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低温胁迫东农冬麦1号SSH文库构建及3个基因表达模式
摘要
冬麦作为我国最主要的粮食作物之一，在低温胁迫环境中的生长和发育问题一直受到广泛关注。本研究利用SSH技术构建了低温胁迫下东农冬麦1号的差异表达基因文库，并通过实时荧光定量PCR技术验证了3个基因在低温胁迫下的表达模式。研究结果表明，低温胁迫下东农冬麦1号表达出的基因主要涉及细胞壁合成、氧化还原、光合作用、物质运输等生物过程。同时，通过分析表明，3个基因在低温胁迫下呈现不同的表达模式，说明东农冬麦1号对低温适应机制的复杂性。
关键词：SSH技术，实时荧光定量PCR，低温胁迫，东农冬麦1号，表达模式
Abstract
AsoneofthemostimportantcropsinChina,winterwheathasalwaysbeenconcernedaboutthegrowthanddevelopmentinthelowtemperaturestressenvironment.Inthisstudy,thedifferentialgeneexpressionlibraryofDongnongWinterWheat1wasconstructedunderlowtemperaturestressbyusingSSHtechnology.Meanwhile,theexpressionpatternsof3genesunderlowtemperaturestresswereverifiedbyreal-timefluorescencequantitativePCRtechnology.TheresultsshowedthatthegenesexpressedinDongnongWinterWheat1underlowtemperaturestressweremainlyinvolvedinbiologicalprocessessuchascellwallsynthesis,oxidation-reduction,photosynthesis,andmaterialtransport.Atthesametime,theanalysisshowedthatthethreegenesshoweddifferentexpressionpatternsunderlowtemperaturestress,indicatingthecomplexityoftheadaptationmechanismofDongnongWinterWheat1tolowtemperaturestress.
Keywords:SSHtechnology,real-timefluorescencequantitativePCR,lowtemperaturestress,Dongnongwinterwheat1,expressionpattern
引言
低温胁迫是一种普遍存在于自然界中的非生物胁迫，对植物的生长和发育造成了严重的影响。作为我国主要的粮食作物之一，冬麦在低温胁迫下也面临着较大的生长和发育压力。因此，研究低温适应机制成为了当前冬麦研究的热点问题之一。
SSH技术是一种分子克隆技术，通过减少不同样品间共同表达的基因而进行差异基因筛选，得到在一个样品中高表达而在另一个样品中低表达的基因的方法，具有灵敏性高、可靠性强等优点。本研究利用SSH技术构建了低温胁迫下东农冬麦1号（以下简称冬麦1号）的差异表达基因文库，并通过实时荧光定量PCR技术验证了3个基因在低温胁迫下的表达模式，以探究冬麦1号应对低温胁迫的基因调控机制。
材料与方法
样品来源
冬麦1号种子在室内发芽生长7天后，移植到含1/2Hoagland溶液的恒温培养箱中，分别进行12℃和25℃的低温胁迫处理24h，以低温胁迫前后的根、茎、叶三个部位为样品。
SSH文库构建
利用TakaraBiotechnology中国有限公司提供的SMARTer™cDNA合成工具进行cDNA合成，进行PCR扩增并纯化后进行SSH反应，得到差异基因文库，转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增和测序。
实时荧光定量PCR技术
利用TakaraBiotechnology中国有限公司提供的SYBR®PremixExTaq酶盒进行反应，在LightCycler®480II检测系统中测定低温胁迫前后根、茎、叶中3个基因的相对表达水平，GAPDH基因作为内参。
结果
SSH文库构建
经过SSH反应后，得到了低温处理前后的差异表达基因文库，从文库中随机选取100个克隆进行序列分析，结果表明，有74个序列能够与已知基因或EST序列匹配，占总序列数的74%。
基因差异表达分析
通过BLAST和GO分析，可以发现在低温胁迫下，冬麦1号表达出的基因主要涉及细胞壁合成、氧化还原、光合作用、物质运输等生物