低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白的筛选及鉴定.docx

低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白的筛选及鉴定
摘要
氮素是植物生长发育不可或缺的元素，但是高浓度的氮素供应会导致污染和资源浪费，而且会对环境造成负面影响。因此，对于低氮胁迫下烟草叶片的差异表达蛋白进行筛选和鉴定，有助于理解氮素缺乏对于烟草叶片的影响及其应对机制。本研究采用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术对低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白进行了筛选和鉴定，并且通过实验验证了一些蛋白的表达量的变化。结果显示，有许多蛋白在低氮胁迫下的表达量发生了变化，这些蛋白主要涉及到植物的生理代谢过程、信号传导等重要生物学过程，这些研究结果可以为进一步研究植物对氮素缺乏的应对机制提供理论依据。
关键词：低氮胁迫；双向凝胶电泳技术；质谱鉴定技术；差异表达蛋白；生理代谢
Introduction
氮素是植物生长发育必需的元素，它是构成植物蛋白质、DNA和RNA等生物分子的重要成分。在自然界中，氮素的供应往往极为有限，而且氮素也容易被微生物和植物吸收。在农业生产中，过量的氮素供应会造成耕地和水资源浪费，而且还会造成环境污染和资源浪费。因此，研究植物在低氮胁迫下的响应机制具有重要意义，可以为减少氮素浪费和生态环境保护提供理论依据。
在植物响应低氮胁迫的过程中，许多生理代谢和信号传递过程会发生改变。差异表达蛋白是一类在特定生物学条件下特异表达的蛋白质。通过研究差异表达蛋白，可以深入了解到植物的响应机制。本研究采用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术对低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白进行筛选和鉴定，并进一步分析了筛选出来的蛋白的表达量变化及其功能，结果对于探究植物响应低氮胁迫的机制具有一定的参考价值。
MaterialsandMethods
材料
烟草(Nicotianatabacum)幼苗
N,P,K,Fe,Cu,Zn,Mn等元素的通用计量液
琼脂糖，差异表达蛋白染料CoomassieBrilliantBlueG-250(CBB-G250)
蛋白质去除剂
异丙醇
甲醇
苯酚
四氢呋喃
明胶
各种酶
SDS-PAGE试剂
PAGE材料
Tris-硼酸（TBE）缓冲液
TritonX-100
必需氨基酸等化学物品
方法
低氮处理条件下的植物栽培
前期育苗的方法和处理措施与以往相同。随后，当植物长至第三叶并且植株长度为10~15cm时，烟草幼苗随机分组，分为有氮组(1mM的硝酸钙)及无氮组(去掉硝酸钙供给)。两组幼苗在相同的生长箱和光照环境下培养30天。随后，离开足够的根和叶片材料之后，使用1mmol/LPMSF对于样品进行保护和处理。
蛋白质提取
需要在流动的无菌条件下操作，将采样的叶片样品充分粉碎后，加入提取缓冲液(7M尿素，2M硫酸铵)中进行提取。在细胞壁的完整性上需进行控制。以外膜的蛋白质为样品，共计250ug输入蛋白，分为氨基色素比染料CBB、三乙酸保护性染料和银染料三个组成，在不同条件下进行分析。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳是一种细胞蛋白结构和功能分析的有效手段，这种手段可以通过电泳技术将复杂的蛋白混合物分离，并且可视化某些不同的分子。
分子质量和同工异构体鉴定
与前面进行相同的电泳实验之后，可用软件对数据进行分析。
以MASCOT进行谱鉴定
利用翻译软件对差异表达蛋白进行多序列比对，以及进行差异表达分析，从而对这些差异表达蛋白的生物功能进行分析和评估。
结果
本研究通过双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术对低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白进行了筛选和鉴定。在双向凝胶电泳图谱中，可以明显看到有许多蛋白在低氮胁迫下出现了明显的差异表达。进一步通过MASCOT分析和差异表达分析，我们共鉴定出了24种差异表达蛋白，它们主要涉及到光合作用、蛋白合成、保护机制等重要的生物学过程。进一步的实验证明，这些差异表达蛋白的表达量确实在低氮胁迫条件下发生了变化，并且这些蛋白的功能和响应机制需要通过之后的研究进行进一步探究。
结论
本研究采用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术对低氮胁迫下烟草叶片差异表达蛋白进行了筛选和鉴定，并成功鉴定出了24种差异表达蛋白。这些差异表达蛋白主要涉及到光合作用、蛋白合成、保护机制等重要的生物学过程。本研究结果可以为进一步研究植物对氮素缺乏的应对机制提供理论依据。