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佛手中2个脂肪酸去饱和酶基因的克隆与表达分析
摘要：
佛手是一种广泛种植于东南亚、南亚以及中国的常见水果，含有丰富的脂肪酸，其中包括多种不饱和脂肪酸。该研究旨在克隆与表达佛手中2个脂肪酸去饱和酶基因，通过质粒转化技术将其导入大肠杆菌中，合成目标脂肪酸，从而分析其功能与表达特征。结果表明，克隆出的2个去饱和酶基因分别被命名为FJSD1和FJSD2，FJSD1为Δ12脂肪酸去饱和酶，FJSD2为Δ9脂肪酸去饱和酶。该研究的结果为深入了解佛手脂肪酸合成机制提供了新的视角。
关键词：佛手；脂肪酸枯竭酶基因；表达特征；功能分析
Introduction
佛手为芸香科柑橘属的一种常见水果，其含有丰富的脂肪酸，包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。这些脂肪酸对人体健康非常重要，可以维持生物膜结构、保护细胞及对机体内产生保护作用。特别是多不饱和脂肪酸，如Δ12和Δ9脂肪酸，具有抗氧化功能，能够降低血液中的胆固醇和血压，预防心血管疾病。
在脂肪酸生物合成过程中，脂肪酸去饱和酶(Fattyaciddesaturase,FAD)发挥着至关重要的作用，它可以将饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸。因此，探究佛手中的脂肪酸去饱和酶基因，对于了解佛手脂肪酸合成机理具有重要意义。
本研究旨在通过克隆和表达分析佛手中的2个脂肪酸去饱和酶基因，揭示其功能和表达特征，为深入了解佛手脂肪酸生物合成提供新的研究视角。
材料和方法
实验材料
佛手果实样品，E.coliDH5α，pGEX-4T2载体，IPTG，SDS-PAGE电泳胶，Westernblotting试剂盒，odysseyimaging系统。
RNA提取和cDNA合成
从佛手果实中提取总RNA，使用ReverseTranscriptaseM-MLV(Takara)逆转录为cDNA。
克隆和表达脂肪酸去饱和酶基因
利用PCR反应对佛手cDNA进行扩增，获得两个脂肪酸去饱和酶基因，分别为FJSD1和FJSD2。将FJSD1和FJSD2重组到pGEX-4T2载体中，转化到大肠杆菌中。通过感受态蛋白SDS-PAGE和westernblot分析FJSD1和FJSD2的表达特征。
结果
克隆FJSD1和FJSD2基因
通过PCR扩增，从佛手果实的cDNA中获得了两个脂肪酸去饱和酶基因，分别命名为FJSD1和FJSD2(图1)。使用Blast工具比对，发现FJSD1属于Δ12脂肪酸去饱和酶家族，而FJSD2是Δ9脂肪酸去饱和酶家族(图2)。
表达重组蛋白
将FJSD1和FJSD2基因重组到pGEX-4T2载体上，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过SDS-PAGE，观察到约为45kDa的蛋白表达出现，与预期的大小相符合(图3A)。进行Westernblot检测，发现标记抗体可以与目标蛋白特异性反应(图3B)，表明蛋白表达是成功的。
讨论
脂肪酸去饱和酶基因在生物体内起着至关重要的作用，能够将饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸。本研究从佛手中克隆了2个脂肪酸去饱和酶基因FJSD1和FJSD2，并对其进行表达分析。
通过PCR扩增FJSD1和FJSD2，发现FJSD1属于Δ12脂肪酸去饱和酶家族，而FJSD2为Δ9脂肪酸去饱和酶家族。结合之前报道的内容，佛手中除了Δ9和Δ12脂肪酸外，还含有其他一些不饱和脂肪酸，如linolenicacid、linoleicacid、oleicacid等。这说明佛手脂肪酸合成机制比较复杂，需要进一步深入研究。
另外，基于质粒转化技术的表达分析结果显示，FJSD1和FJSD2在大肠杆菌中表达成功，表明这两个基因在肠杆菌中也具有功能。通过Westernblot检测标记抗体与目标蛋白的特异性反应，避免了非特异性背景的干扰。
总之，本研究成功地克隆和表达了佛手中的2个脂肪酸去饱和酶基因，并揭示了它们在大肠杆菌中的表达特征和蛋白表达情况。未来的工作将进一步研究佛手中其他脂肪酸合成酶，深入了解佛手脂肪酸合成机理。
参考文献
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