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人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达
引言
铁是人体必需元素之一，乳铁蛋白是哺乳动物乳汁中含量最高的铁结合蛋白。乳铁蛋白可以稳定铁离子，在乳汁中起到保护铁的作用。因此，乳铁蛋白对婴儿的生长发育至关重要。
人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达是一个为了提高乳酸菌饮品抗贫血能力、增强保健功能的研究方向。本文主要介绍人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达的研究进展。
一、人乳铁蛋白基因的克隆
1.1人乳铁蛋白基因的特点
人乳铁蛋白基因(LTF,lactoferrin)位于人类染色体3的第21.1-21.2位置，由17个外显子组成，总长2.5kb。LTF基因编码的蛋白质是一个76kDa分子量的酸性糖蛋白。
1.2克隆人乳铁蛋白基因的方法
已有多种方法用于人乳铁蛋白基因的克隆，如PCR法、南方印迹法、北方印迹法和文库筛选法等。其中PCR法是最为常用的方法。
1.2.1PCR法
首先需要设计一对与LTF特异性序列相邻接的引物(一般是5’端和3’端各50bp)，基于公开数据库中LTF序列的信息进行设计，PCR扩增出LTF基因的cDNA。PCR扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
1.2.2南方印迹法
将PCR扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，将DNA迁移至硝酸纤维素膜上，与其特异性的LTF探针杂交后用辐射探测方法进行检测。南方印迹法是克隆LTF基因的常见方法之一。
1.2.3北方印迹法
将RNA经甲醛定性处理后，通过琼脂糖凝胶电泳分离，将RNA迁移至硝酸纤维素膜上，用LTF特异性的DNA探针进行杂交，最后用辐射探测方法进行检测。北方印迹法一般用于LTF基因的转录水平检测。
1.2.4文库筛选法
文库筛选法是利用同源性原理，将基因组或cDNA文库进行大量筛选，寻找与LTF基因高度同源的克隆体，并从中筛选出目标片段进行PCR扩增。
二、LTF基因在乳酸菌中的表达
将LTF基因克隆到乳酸菌基因组中，可以生成转基因乳酸菌，用于生产LTF饮品。LTF饮品具有增强机体免疫力，抗病毒感染等健康功效，因此具有很高的发展前景。
2.1LTF基因在乳酸菌中的克隆方法
乳酸菌基因组包含多个质粒，选择合适的质粒将LTF基因转入细胞内，实现LTF基因在乳酸菌中的表达。
2.2不同乳酸菌中LTF基因表达的差异
LTF基因在不同乳酸菌中的表达水平存在较大差异，多种乳酸菌中LTF基因的表达水平如下：Lactobacillusacidophilus>Lactobacillusrhamnosus>Streptococcusthermophilus>Lactobacillusreuteri>Lactobacillusplantarum。
结论
当前，人乳铁蛋白基因的克隆及其在乳酸菌中的表达已经成为了一个研究的热点。通过PCR法、南方印迹法、北方印迹法和文库筛选法等方法可以成功克隆LTF基因。将LTF基因克隆到乳酸菌基因组中，实现LTF基因表达，可以用于生产LTF饮品，具有很高的发展前景。