三角褐指藻随机插入突变体库的建立及产油藻株的筛选.docx

三角褐指藻随机插入突变体库的建立及产油藻株的筛选
引言
光合作用是一种重要的碳固定过程，为生命的存在和发展提供了基础的能量和碳素来源。在近年来全球能源危机的背景下科学家们开始关注利用微藻进行生物质和油脂的生产，以满足人类的需求。然而微藻产油筛选中的低产油率、生育周期长和难以实现高密度大规模稳定培养等问题制约着微藻产油技术的发展。因此，研究如何高效产油的微藻种类，是微藻工程技术的重要方向之一。
三角褐指藻作为一种单细胞海水藻类，具有生长周期短、生长速度快、较高的油脂含量等优点，被广泛认为是一种理想的产油微藻。通过遗传工程手段，改造三角褐指藻的生长特性和代谢途径，可大幅度提高其产油率，具有巨大的应用潜力。因此，本研究建立了三角褐指藻突变体库，并通过产油筛选，为进一步提高三角褐指藻产油性能打下了良好的基础。
材料与方法
1.培养基
采用有机碳无机氮复合培养基BG-11，其成分为（g/L）：
NaNO3..........................1.5
K2HPO4.......................0.04
MgSO4·7H2O..............0.075
CaCl2·2H2O.................0.036
Citricacid.......................0.006
FeSO4·7H2O................0.01
EDTA-2Na......................0.0075
traceelementsolution.1ml(含（g/L））
H3BO3..............................2.86
MnSO4·H2O....................1.81
ZnSO4·7H2O...................0.22
CuSO4·5H2O...................0.08
Na2MoO4·2H2O..............0.39
CoSO4·7H2O..................0.05
2.突变体库建立方法
选取500个正常生长的三角褐指藻菌株，分别称取适量的细胞悬液，其中100μl悬液放置60度高温培养箱中加热5分钟，另外400μl细胞悬液直接保存备用。高温处理后的悬液分别加入50μl、30μl、10μl、5μl、3μl、1μl离心管中，分别标记为A、B、C、D、E、F组，每组分别选择10个离心管，加入100μl的BG-11培养液中，使之再生长，直至有细胞生长出，即开始建库。采用同样方法备份至3级，每级备份比例均为1：10^4。
3.产油藻株筛选方法
初步筛选，采用格里高利培养皿选择青绿色的微团两周后挑选出油球含量众多的多细胞菌株，称取50mL菌液以5,000r/min离心1min，倒掉上清液，沉淀用正己烷提油。将提取的油亚垂直入管，站定后取上层油，用称量瓶称定重量，得出每升培养液中的油的质量（mg/L）。选取质量最高的藻株一级进行次级筛选，以此类推，直至得到油脂含量较高的三角褐指藻菌株。
结果与讨论
1.观察突变体库
将建立好的突变体库进行观察，发现在经过高温处理后仍没能存活的细胞数量较少，并且存活的细胞有不同程度的形态改变。通过观察发现，A组和B组中沉积下去的细胞数目较多，说明这两组中有些菌株已经死亡，或者是由于受到较高的温度处理导致其代谢状态改变，不再能够正常生长繁殖。
2.针对突变体库的油脂含量筛选
通过初步筛选发现油脂含量较高的菌株，共筛选出30个高产油的菌株，其中油脂含量最高的菌株为QW-02株，产油率达到2.7mg/L。目前正在进行次级筛选，筛选出油脂含量最高的菌株，为进一步提高三角褐指藻产油性能打下良好的基础。
总结
本研究成功建立了三角褐指藻突变体库，并通过初步的油脂含量筛选，筛选出油脂含量较高的菌株，为进一步提高其产油性能打下了基础。随着微生物技术的不断发展，我们相信通过遗传工程的手段，将微藻工程化，创造出更具优势的产油微藻菌株，从而更好地满足我们对能源的需求。