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三种分支杆菌多重PCR快速检测方法及牛分支杆菌HRCA检测方法的建立
引言：
分支杆菌是一类常见的细菌，广泛分布于自然界中，其中有一部分可以引起人、动物等生物的疾病。在牛的养殖中，分支杆菌是一种常见的病原体，牛分支杆菌感染症状严重，可以引起瘤胃炎、腹泻、呼吸系统疾病等严重症状。因此，对于牛分支杆菌的快速检测方法的研究具有重要的意义。
本次研究主要通过建立三种分支杆菌的多重PCR快速检测方法和牛分支杆菌HRCA检测方法，对于分支杆菌的快速检测具有一定的参考价值。
方法：
1.分支杆菌多重PCR快速检测方法
在本次实验中，我们使用了三种分支杆菌标准菌株：细菌学家根氏菌（Actinomycesodontolyticus）、普鲁斯菌（Prevotellaintermedia）和色链球菌（Fusobacteriumnucleatum）。采用多重PCR方法，针对这三种菌株的特异性标记位点进行快速扩增。
操作步骤：
（1）对多个分支杆菌标准菌株进行培养。
（2）收集培养得到的菌液，并使用方法进行DNA提取。
（3）PCR程序:热盖95℃3min+95℃30s+56℃30s+72℃30s循环20个周期+72℃10min、4℃反应结束。PCR扩增体系具体为：2XTaqMasterMix12.5μl、ForwardPrimer（10μM）0.5μl、ReversePrimer（10μM）0.5μl、DNA模板2μl、DDW19.5μl，反应总体积25μl。
（4）PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，以判断PCR扩增的结果。
2.牛分支杆菌HRCA检测方法
该方法实现了针对牛分支杆菌的快速检测，通过检测样本中是否含有牛分支杆菌的特异性标记位点进行判断。
操作步骤：
（1）从牛分支杆菌感染的患畜体内获取重要的组织标本，如脾、淋巴结等。
（2）使用方法进行DNA提取。
（3）HRCA预混液的制备：
将React1（1ug/ml双链DNA）和React2（5X0.5MNaCl/10mMTris-HCl/0.1%Tween-20/25mMMgCl2）混合制备成50μl的重掺液。
（4）PCR扩增程序：热盖95℃3min+95℃30s+68℃30s(循环70个周期)+4℃反应结束。PCR扩增体系如下：2×TaqMasterMix25μl、React17.5μl、React2（10μM）0.5μl、牛分支杆菌过渡抗原ADN236（10ng/ul）2μl、DDW15μl，总体积为50μl。
（5）PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，以判断PCR扩增的结果。
结果：
1.分支杆菌多重PCR快速检测方法
通过实验，我们发现三种分支杆菌标准菌株的DNA序列在25个PCR循环之后都得到了扩增。最终的PCR扩增产物分别为867bp（细菌学家根氏菌）、880bp（普鲁斯菌）、674bp（色链球菌）。
2.牛分支杆菌HRCA检测方法
结果显示，牛分支杆菌感染标本在HRCA检测中得到了成功扩增，最终产物为约1000bp的带状膜。
结论：
本次实验通过建立三种分支杆菌的多重PCR快速检测方法和牛分支杆菌HRCA检测方法，为分支杆菌的快速检测提供了一定的参考价值。同时，我们也发现这些方法在实验室和疾病防控中有着广泛的适用价值。这些方法的建立也为分支杆菌相关的疾病的研究奠定了基础，有望为相关疾病的预防和治疗提供更加有效的手段。