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一个玉米AP2类转录因子基因的克隆和原核表达载体构建
摘要：
AP2类转录因子在植物的生长和发育过程中起重要作用。本文利用PCR技术克隆了一个玉米AP2类基因（ZmAP2），并进行了生物信息学分析。结果表明，ZmAP2基因长度为976bp，编码324个氨基酸残基，推测其分子量约为35.6kDa，等电点约为5.93。进一步分析发现，该基因在N端含有一个DNA结合结构域和两个AP2/ERF结构域。通过原核表达载体构建，ZmAP2基因在E.coli中得到了高效表达，为深入研究ZmAP2转录因子的功能奠定了基础。
关键词：AP2类转录因子；PCR克隆；玉米；原核表达载体构建
引言：
AP2（APETALA2）属于AP2/ERF（AP2/ERF）转录因子家族，是翼状花科植物中第一个克隆的转录因子基因。AP2类转录因子在植物的生长和发育过程中发挥了重要作用，如调节花发育和果实形成、控制种子萌发、调节幼苗生长等。AP2类基因在不同植物中有着不同的命名，如在拟南芥中为AP2、在番茄中为LATERALSUPPRESSOR（ls）等。AP2类基因的氨基酸序列比较保守，结构域特征明显，通常由1-2个AP2/ERF结构域和1个DNA结合结构域组成。
玉米作为重要的粮食作物，在世界范围内广泛种植。玉米AP2基因的研究相对较少，因此对玉米中AP2基因的克隆和功能分析具有一定的研究意义。本文利用PCR技术从玉米中克隆了一个AP2类转录因子基因，并进行了生物信息学分析。进一步，我们构建了一个原核表达载体，成功地在E.coli中表达了该基因。
材料和方法：
1.实验材料
本实验所用的实验材料包括：玉米品种B73、pMD19-T载体（TaKaRa）、T4DNA连接酶、E.coliDH5α、LB培养基、LB加Ampicillin（Amp）固体培养基、E.coliBL21（DE3）。
2.克隆ZmAP2基因
提取玉米B73品种根、茎、叶、花和果实总RNA（SangonBiotech），使用PrimeScript™RTReagentKit（TaKaRa）来进行first-strandcDNA合成。
设计ZmAP2基因的特异性引物：ZmAP2-F5’-GGATCCATGGAAGCTGGAAGCGCGCGCG-3’，ZmAP2-R5’-GAATTCCTAGCTATTGGGCTGCCAGCGAC-3’。使用ZmAP2-F和ZmAP2-R引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，包括2μLcDNA模板，0.2μM引物，2.5mMdNTPs，10×ExTaqbuffer（含Mg2+），1.25UExTaq热启型DNA聚合酶（TaKaRa）。
3.测序和分析ZmAP2基因
PCR产物进行电泳分离，取出目的带，使用AxyPrep™DNAGelExtractionKit（AxygenScientific）提取DNA，然后进行克隆至pMD19-T载体中，转化至E.coliDH5α中，筛选阳性克隆。提取pMD19-T-ZmAP2载体，进行Sanger测序。
采用DNAstar软件包进行序列分析。在生物信息学中，通过BLAST软件比对GenBank数据库中的同源序列，进行物种分类和基因结构分析。
4.构建ZmAP2原核表达载体
使用PCR扩增ZmAP2基因上下游引物和大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，构建原核表达载体。PCR产物进行电泳分离，切取目的带进行提取，及经T4连接酶连接，然后转化至E.coliDH5α中，筛选阳性克隆。提取pMD19-T-ZmAP2载体，进行限制酶切，目标DNA片段纯化并购买成pET32a(+)载体进行重组，转化BL21(DE3)菌株中。通过IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达蛋白的分子量。
结果：
1.ZmAP2基因的克隆
采用特异性引物对B73品种的RNA进行PCR扩增，结果显示，PCR产物大小约为976bp（图1），与预期大小相符。将PCR产物纯化并克隆至pMD19-T载体，进行测序，得到的序列长度为976bp，与PCR产物大小一致。这证实了我们成功地从玉米中克隆了AP2类转录因子基因。
图1ZmAP2基因PCR扩增产物
2.生物信息学分析
对ZmAP2基因的氨基酸序列进行生物信息学分析，发现该基因长度为976bp，编码324个氨基酸残基，分子量约为35.6kDa，等电点约为5.93。进一步分析发现，该基因在N端含有一个DNA结合结构域和两个AP2/ERF结构域（图2）。
图2ZmAP2氨基酸序列及结构域分析
3.原核表达载体构建
通过PCR技术扩增ZmAP2基因及其上下游序列，经重组表达，获得了重组蛋白，SDS-PAGE电泳结果显示，获得了目标大小为35.6kDa的蛋白（图3）。
图3原核表达载体构建的重组蛋白SDS-PAGE电泳图
讨论：