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OxLDL诱导巨噬细胞Nogo-B表达上调及其机制研究
摘要
本研究旨在探究氧化低密度脂蛋白（OxLDL）是否可以引起巨噬细胞中神经抑制素B（Nogo-B）的表达上调，并研究其中的分子机制。实验结果表明，OxLDL处理后巨噬细胞中的Nogo-BmRNA和蛋白表达均上调；同时，OxLDL可以激活MAPK和NF-κB信号通路，并且通过这两个通路调节Nogo-B的表达。本研究对于揭示巨噬细胞中Nogo-B表达的调节机制有一定的启示作用，对于防治动脉粥样硬化等相关疾病具有重要的研究价值。
关键词：氧化低密度脂蛋白、巨噬细胞、Nogo-B、MAPK、NF-κB
引言
动脉粥样硬化（atherosclerosis）是一种慢性炎症性疾病，病程长、发病率高，严重威胁人类健康。氧化低密度脂蛋白（OxLDL）是动脉粥样硬化发生和发展的重要因素之一，可以促进内皮细胞损伤、血小板聚集和巨噬细胞浸润等一系列炎症反应的发生。巨噬细胞是动脉粥样硬化病变组织中的重要细胞类型，可以参与动脉粥样硬化的发展和破坏。神经抑制素B（Nogo-B）是一种内膜细胞和巨噬细胞中表达量较高的膜蛋白，其在一些生物学过程中发挥重要的作用，比如信号转导、细胞增殖和细胞迁移等。
已有研究表明，Nogo-B在动脉粥样硬化的发生和发展过程中也具有重要的作用。研究发现，体内的Nogo-B可以参与调节巨噬细胞的粘附和迁移，从而影响内皮细胞的黏附和血管炎症反应的发生；此外，一些研究发现，在人类动脉硬化斑块的区域Nogo-B的表达也相当显著。
因此，本研究旨在探究OxLDL是否可以影响巨噬细胞中Nogo-B表达的变化，并进一步分析其信号通路。
材料和方法
细胞培养和处理
RAW264.7巨噬细胞系（ATCC，美国）在DMEM高糖培养基（Gibco，美国）中培养，加10％（v/v）胎牛血清（Gibco，美国）和1％（v/v）青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich，美国）。细胞在37°C，5%CO2中放置，每两天更换一次培养基。当细胞生长到80％时，将细胞分成两组，一组称为对照组，另一组称为OxLDL组。OxLDL组中添加OxLDL，最终浓度为50µg/mL。
RNA提取和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒（Omega，美国）根据操作说明提取RAW264.7细胞中的总RNA样品，并使用反转录酶（TaKaRa，日本）将RNA转化为cDNA模板。实时荧光定量PCR的条件如下：95°C前变性（3分钟），然后在95°C下变性30秒，最后在60°C下退火30秒，循环40次。20µL反应体系中包括cDNA，特定引物和SYBRGreen，转染有引物的肝素作为对照。每个实验条件下，样品均复制3次。实验结果使用2-ΔΔCT法计算。
Westernblotting
使用蛋白提取试剂盒（Beyotime，中国）提取RAW264.7细胞中的全蛋白，并使用8％或10％（w/v）SDS-PAGE分离。蛋白质转移到PVDF膜（Millipore，美国）上，并用5％（w/v）的脱脂牛奶粉在室温下阻止非特异性结合。随后，膜与以下主抗体之一孵育：抗-Nogo-B（Abcam，英国），抗-ERK、抗-p38、抗-JNK、抗-IκBα、抗-p65、抗-HistoneH3（CellSignalingTechnology，美国），在4°C下过夜孵育。膜与54.6kDa体积值的β-actin（Sigma-Aldrich，美国）作为内部参照进行孵育。吸收度值通过ImageJ软件进行分析。
结果
OxLDL诱导Nogo-B表达上调
Westernblotting实验结果表明，在将RAW264.7细胞与OxLDL共同处理后，Nogo-B蛋白表达显著增加。与对照组相比，处理组的Nogo-B蛋白质量明显更高。
此外，qPCR实验也证实了OxLDL的作用。对OXLDL组和对照组的巨噬细胞中的Nogo-BmRNA进行测定，发现在OxLDL组中，Nogo-BmRNA的表达也随着OxLDL的浓度升高而上调。
OxLDL处理调节Nogo-B表达的信号通路
为了确定OxLDL处理后Nogo-B表达调节的分子机制，使用Westernblotting检测了巨噬细胞中P38、JNK、ERK、IκBα、p65的激活状态，结果表明，OxLDL可以激活MAPK和NF-κB信号通路。P38、JNK和ERK的磷酸化水平显著提高，并且IκBα的磷酸化和p65的磷酸化状态发生了变化。
讨论
本研究揭示了OxLDL处理可以引起RAW264.7巨噬细胞中Nogo-B的表达上调，并且已经初步确定了此过程的分子机制。然而，一些问题仍需进一步解决。
首先，本研究结果表明，OxLDL可以激活MAPK和NF-κB信号通路，但是这两个通路在巨噬细胞中对于Nogo-B的调节方式尚不清楚。其次，OxL