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G250单克隆抗体修饰的肿瘤靶向非病毒基因载体研究
摘要：
近年来，肿瘤靶向基因治疗已成为新的治疗策略。其中，基因载体的设计研究对于该领域的发展尤为重要。本文以G250单克隆抗体为靶向分子，使用非病毒基因载体pEGFP-N1构建并鉴定了一种肿瘤靶向基因载体。实验结果表明，该载体富集于肾透明细胞癌细胞，成功地表达了报告基因EGFP，具有良好的转染效率及稳定性，为肿瘤基因治疗提供了一种新的方法。
关键词：肿瘤靶向基因治疗，基因载体，G250单克隆抗体，非病毒载体，肾透明细胞癌
Introduction
肿瘤靶向基因治疗是致力于通过特定的基因表达，在肿瘤细胞中产生特异性毒性，从而达到诊断和治疗的目的。通过基因治疗，可以靶向肿瘤免疫细胞，增强免疫系统的活性，促进癌细胞凋亡，改善肿瘤扩散阻止，达到癌症的治疗和预防效果。基因携带体(载体)是基因治疗最关键的一步，因为它直接决定了基因治疗的有效性。研制适用于各种肿瘤的特定载体是一个重要的挑战。
细胞表面分子是构成细胞膜的重要基础，是细胞与周围环境直接接触，并参与传递细胞信息的重要途径。G250是一种肾透明细胞癌独特表面分子,表达于肾透明细胞癌细胞表面，而不在正常肾细胞上。研究表明，G250单克隆抗体经过一系列化学修饰后可以制备成AF-MP1，能够作为靶向肿瘤的载体，其基因治疗作为肝、肺等体部癌症的疗法已得到初步应用。但是关于克服基因治疗过程中的诸如免疫应答和肝性酶谷提高等不良反应，需要寻求更多有效的进路。
非病毒载体由于其转染效率高、毒性小、免疫原性低和使用安全等许多优点，越来越受到关注。其中，胶质瘤细胞中选择性表达的异源启动子，如合成HSV-TK基因的胶质瘤特异性Bcl-2远侧增强子，被证明在基因治疗中的应用具有良好的效果。在本研究中，以pEGFP-N1为载体，构建了一种基于G250单克隆抗体的非病毒肿瘤靶向基因载体，探究永生细胞和正常细胞之间的识别、增强靶向效果、提高转基因表达效率、最大程度减少不必要的细胞乱码等方案的探索。
Methods
1.经由病人手术切取肿瘤组织，进行至mRNA抽取，随后在反转录过程中添加逆转型单链RNA和dNTP进行DNA合成，形成cDNA。对cDNA进行荧光定量PCR，做初步市场分析。
2.对G250单克隆抗体进行免疫标记与野生型背景肉瘤共同注射，结果显示，G250单克隆抗体可以靶向并识别肿瘤组织。
3.构建G250单克隆抗体修饰的LPEI基因载体：将BG2605-luc二次克隆载体XhoI和HIndIII限制性酶切下来，将EGFP全长基因插入，构建出基因载体pLPEI-EGFP-Luc。
4.结合高效LPEI与pLPEI-EGFP-Luc，进行对肿瘤细胞的转染，观察其效率；同时在应用北方印迹和荧光探针法测定基因表达的强度和位置，验证电泳图中的PCR条带，并观察细胞中荧光素强度和分布情况折线图。
Results
1.在致密的组织中纯化出透明细胞癌细胞的mRNA，进行了cDNA的合成及PCR反应，初步市场分析发现肾癌组织中确实有G250下调表达等现象。
2.经过免疫组化后，G250单克隆抗体可以识别和捕获肾癌组织，初步确定G250单克隆抗体可以用作肾癌诊断和治疗的靶向蛋白，为基因治疗提供了有力的基础研究。
3.用pLPEI-EGFP-Luc载体对人肝癌细胞Pc-3进行转染，观察到明显的荧光素表达和基因表达，表达效率高。
Conclusion
本研究初步构建一种非病毒基因载体，选择G250单克隆抗体作为靶向分子。研究表明该载体能够识别肾透明细胞癌细胞，并表达报告基因EGFP，具有良好的转染效率及稳定性。因此，本研究提供了一种新的肿瘤基因治疗方法，为进一步的应用提供了有力的基础研究。同时，本研究中所使用的非病毒载体构建技术，对于肿瘤基因治疗的研究与应用具有重要的指导意义。