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猫杯状病毒2280毒株反向遗传系统的建立及初步应用的开题报告
一、研究背景
猫杯状病毒（Felinecalicivirus,FCV）是一种单股正链RNA病毒，是家猫中最为常见的病毒之一，对猫的呼吸道和口腔黏膜有感染作用。在近几年，FCV却被证明对人类带来了潜在的威胁，尤其是在禽流感与新冠病毒肆虐的背景下，我们面临更复杂的流行病学形势。因此，对猫杯状病毒进行深入研究，是防范人类流行病的一部分重要措施。
反向遗传系统是近年来开发出地一种基于分子遗传学的新技术，可以研究病毒遗传信息的功能和机理。通过在病毒RNA上嵌入外源的报告基因，反向遗传系统可以使研究人员以前所未有的高度控制病毒的复制和转录。因此，建立猫杯状病毒的反向遗传系统，可以为深入研究猫杯状病毒的基础遗传学提供有效手段。此为研究的目标。
二、研究方法
1.病毒分离与纯化
通过向临床医学中心的猫杯状病毒阳性样本中接种MDCK细胞，培养3至5天，并进行复式纯化操作。使样本中的病毒更加纯化。
2.反向遗传系统的构建
基于已有的反向遗传系统构建方法（Katohetal.2019），我们将pMCS-EGFP表达载体构建为FCV2280类型反向遗传系统的表达载体。并通过限制性内切酶切割和连接引物扩增的方法，将此表达载体与FCV-2280病毒的UPF1产物连接起来。然后将此重组载体在细胞中进行瞬时转染，通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的发光情况，确定其在病毒中的表达情况。
3.反向遗传系统的验证
我们将上一步合成的构建体通过转染法引入MDCK细胞，并根据之前已有的成熟方法，利用PCR测序的方法对其进行检测。通过在转录起始侧准确嵌入EGFP基因并在猫杯状病毒的复制和转录中稳定表达EGFP基因，证实了我们所构建的反转录FCV-2280遗传系统的有效性。
三、预期成果
通过该研究，我们预期完成如下主要工作：
1.成功地构建了猫杯状病毒2280毒株的反向遗传系统。
2.通过绿色荧光蛋白作为报告基因来显示该反向遗传系统的运作情况。
3.该研究为深入研究猫杯状病毒的基础遗传学创建了有效工具。
四、意义
FCV病毒早期研究主要集中在验证其是否能感染人类，然而随着新冠疫情的大流行，我们们需要更加全面、深入地研究FCV的遗传变异及其反向遗传系统。本研究可以为了解病毒在不同宿主中的基础分子机制，从而设计出更全面的防治方案，提供新的研究思路，也为将来针对FCV的疫苗设计和防治措施提供了理论基础。