野生黄花苜蓿SKIP同源基因cDNA的克隆与分析的开题报告.docx

野生黄花苜蓿SKIP同源基因cDNA的克隆与分析的开题报告
【开题报告】
一、研究背景及意义
黄花苜蓿（MedicagosativaL.）是世界上重要的草地经济作物之一，具有豆科作物的固氮功能，能通过与根瘤菌共生，将空气中的氮转化为易于植物利用的氮素。因此，黄花苜蓿被广泛应用于草地修复、饲料生产、生物质生产等方面。因此，研究其基因结构、调控机制、功能性状等，对于推进优良品种选育和黄花苜蓿的生产与利用具有重要作用。
SKIP蛋白是动植物细胞中高度保守的蛋白质，属于Ski/Sno家族，并具有基因调控和信号转导功能。SKIP在拟南芥（Arabidopsisthaliana）中被证明是招募组蛋白乙酰转移酶到多个基因的调节子上，从而影响基因表达的一个关键因子。之前已经对Skip基因相关的信息在牛、猪、大鼠、家兔等动物基因组序列中分析，但对于黄花苜蓿种类中SKIP的来源和功能还没有深入研究，为该领域的研究提供了广阔的空间。
因此，本研究将进一步以黄花苜蓿SKIP同源基因为研究对象，开展cDNA克隆及表达分析，以进一步揭示黄花苜蓿的基因调控机制，同时为植物基因工程利用提供技术和理论支持。
二、研究思路
（1）获取SKIP同源基因信息
通过参考NCBI和GeneBank等基因库，检索相关SKIP基因序列，确定SKIP同源基因的引物设计。
（2）黄花苜蓿RNA的提取及cDNA合成
选取小叶苜蓿中的幼苗为实验材料，采用Trizol法提取幼苗总RNA；将RNA进行DNaseI处理并转录成cDNA。将合成的cDNA作为荧光定量PCR的模板。
（3）SKIP同源基因的克隆和鉴定
根据引物设计,使用PCR反应扩增SKIP同源基因的全长cDNA，后进行蛋白质分子量的预测，以及蛋白二级结构预测和保守域分析。
（4）表达分析
采用荧光定量PCR进一步检测SKIP基因在黄花苜蓿中的表达情况，并观察在不同条件下SKIPmRNA对拟南芥中H2A基因转录表达的瞬时效应。
三、研究可能存在的问题及解决措施
问：SKIP同源基因在黄花苜蓿中的表达量如何确证？
答：采用荧光定量PCR技术，结合内参基因测定SKIP同源基因的表达强度，降低实验误差。
问：黄花苜蓿SKIP同源基因cDNA克隆的难点在哪里？
答：克隆SKIP同源基因cDNA的难点在于其序列保守性一般较高，中间编码区域含有较多的G/C碱基，且基因长度较长。因此，合理设计引物、采用优化反应条件，结合克隆纯化技术等手段均可有效解决。
四、预期结果
通过cDNA克隆及表达分析，研究黄花苜蓿SKIP同源基因的基因结构与编码蛋白结构、规律性表达等，对黄花苜蓿遗传学、分子生物学和生物技术等领域的发展具有重要推动作用。