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脂联素基因敲除小鼠血管钙化及其钙化机制的研究的任务书
任务书
一、研究背景
血管钙化是由于血管内膜平滑肌细胞和成纤维细胞向周围基质分泌大量胶原蛋白及其他非胶原蛋白，钙盐在其中沉积，导致动脉硬化和心脑血管疾病的重要原因之一。近年来，钙代谢异常和脂质代谢紊乱在血管钙化进程中受到越来越多的关注，其中脂联素（adiponectin）作为一种与胰岛素对抗作用的脂肪细胞因子，在体内能够调节脂质代谢，同时对血管内皮细胞和平滑肌细胞的功能有重要影响。研究证实，脂联素重组蛋白可以通过一系列机制参与血管钙化的防治过程，但是脂联素基因敲除对血管钙化的影响及其分子机制还未被深入研究。
二、研究目的
本研究旨在分析脂联素基因敲除小鼠在血管钙化进程中的表现，阐明脂联素对钙代谢过程和血管内皮及平滑肌细胞功能的影响，揭示基因敲除对血管内皮及平滑肌细胞信号传导的调控机制。
三、研究方法
1.选择目的基因脂联素，利用基因工程技术建立脂联素基因敲除小鼠模型，通过PCR和Westernblot等方法确认基因敲除效果。
2.通过HE染色及石蜡切片技术观察小鼠主动脉的形态和组织学结构，并利用Alizarin染色观察血管钙化程度。
3.采用细胞培养技术，分离骨头、结缔组织或血管平滑肌细胞（VSMCs），以正常小鼠和脂联素基因敲除小鼠的VSMCs为研究对象，采用Westernblot等方法检测相关蛋白水平或基因表达水平。
4.应用蛋白质芯片技术对小鼠血浆中蛋白质进行全面分析，通过计算机辅助分析和绘图呈现蛋白质的表达模式，筛选出与血管钙化相关的蛋白质。
5.采用分子生物学技术，分别构建脂联素转染和敲除小鼠VSMCs染色体、质粒、腺病毒载体，利用Luciferase报告基因进行功能分析，共同探究脂联素对血管内皮及平滑肌细胞信号通路的影响。
四、研究意义
1.阐明脂联素基因应对血管钙化的机制，为发明新型血管钙化治疗方案，提供参考。
2.增进对脂联素在小鼠体内对血管钙化的调控作用的了解，从而更准确地认知该基因对心脑血管疾病的影响。
3.通过分析相关分子机制，为脂联素在心脑血管疾病预防与治疗中的应用提供依据。
4.本研究也将为我们进一步研究肥胖、代谢性紊乱等多种疾病与血管钙化的关系提供科学依据。
五、研究预期成果
1.脂联素基因敲除小鼠主动脉表现出更高的钙化程度，在蛋白质水平上和基因表达水平上表现出相应变化。
2.脂联素基因敲除小鼠VSMCs表现出一些钙化水平和信号通路的变化，这些变化与小鼠主动脉的形态和组织学结构有关。
3.在小鼠血浆中检测到一系列钙化相关蛋白质，深入探究其与脂联素对钙代谢过程和血管内皮及平滑肌细胞功能的影响。
4.研究出脂联素在调控血管内皮细胞与平滑肌细胞信号转导通路方面的新作用，揭示相关的分子机制。
六、工作计划
第一年
1.设计并建立脂联素基因敲除小鼠，建立小鼠主动脉血管钙化模型，进行HE染色、石蜡切片等检测技术的学习和实践。
2.通过Westernblot等方法对脂联素基因敲除小鼠样本和正常小鼠样本进行相关蛋白酶水平的检测。
第二年
1.对血管钙化相关蛋白质进行早期筛选并分析，建立血浆分析平台。
2.对VSMCs分离和培养等技术进行学习和实践，利用脂联素转染和敲除小鼠VSMCs进行实验，分析脂联素对这些细胞的各种影响。
第三年
1.进行任意需要的实验以完善研究结果，解释研究发现，并撰写相关研究论文。
2.对发现的重点内容进行进一步深入的研究，挖掘与血管钙化相关的其他因素，进一步解读和探讨脂联素基因敲除小鼠血管钙化的内在机制。
七、预期经费
总经费约为30万元，其中包括小鼠建立和实验所需费用、实验室设备购置费以及工作人员工资、差旅费、论文出版费等。