鸡MHCⅡ类分子基因片段原核表达及其单抗的制备与鉴定的任务书.docx

鸡MHCⅡ类分子基因片段原核表达及其单抗的制备与鉴定的任务书
任务书
一、任务背景
MHC类分子是免疫系统中一个重要的基因家族，主要包括MHCⅠ类和MHCⅡ类分子。MHCⅠ类分子一般表达于所有核细胞和多数细胞表面，介导CD8+T细胞的识别和杀伤作用；而MHCⅡ类分子主要表达于专职抗原递呈细胞如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞表面，介导CD4+T细胞的激活和细胞免疫应答，是抗原递呈与T细胞激活的必须因子。因此，MHCⅡ类分子在细胞免疫应答中具有重要的作用。本次任务旨在通过原核表达系统表达和纯化鸡MHCⅡ类分子及其单抗，为后续对鸡MHCⅡ类分子的研究提供有力的支持。
二、任务内容
1.鸡MHCⅡ类分子基因的克隆和构建表达载体，包括MHCⅡ类分子的α链和β链。
2.基于原核表达系统，利用大肠杆菌表达鸡MHCⅡ类分子，执行包括原核表达、诱导表达、菌体收获、细胞破碎、纯化等实验。
3.利用表达的鸡MHCⅡ类分子制备单抗，执行包括小鼠免疫、脾细胞融合、克隆筛选、扩增纯化等实验。
4.鉴定鸡MHCⅡ类分子和单抗的纯度和功能，执行包括SDS-PAGE、Westernblot、流式细胞术等实验。
5.编写实验报告，总结实验结果，讨论实验中存在的问题和改进方案。
三、实验步骤
1.鸡MHCⅡ类分子基因的克隆和构建表达载体
（1）从鸡脾组织中提取总RNA，倒转录反应得到cDNA。
（2）设计特异性引物，利用PCR技术扩增鸡MHCⅡ类分子的α链和β链基因片段。
（3）将α链和β链基因片段克隆到原核表达载体中，构建表达载体。
2.利用原核表达系统表达鸡MHCⅡ类分子
（1）转化表达细胞，筛选阳性菌株。
（2）诱导表达，利用IPTG诱导鸡MHCⅡ类分子的表达。
（3）菌体收获，利用超声破碎法或高压法破碎细胞壁，得到菌体。
（4）纯化，采取离心、层析等技术纯化鸡MHCⅡ类分子。
3.利用表达的鸡MHCⅡ类分子制备单抗
（1）小鼠免疫，将纯化的鸡MHCⅡ类分子注射于小鼠，获得小鼠脾细胞。
（2）细胞融合，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
（3）克隆筛选，采用HTP法或限稀稀释法，从杂交瘤细胞中筛选出分泌单抗的杂交瘤细胞克隆。
（4）扩增纯化，选取单抗高产的杂交瘤细胞克隆，进行扩增纯化。
4.鉴定鸡MHCⅡ类分子和单抗的纯度和功能
（1）SDS-PAGE，采用10%SDS-PAGE对鸡MHCⅡ类分子和单抗进行分离和检测。
（2）Westernblot，利用Westernblot方法对鸡MHCⅡ类分子和单抗进行检测。
（3）流式细胞术，利用流式细胞术检测单抗的免疫活性。
5.编写实验报告
总结实验结果，讨论实验中存在的问题和改进方案，撰写实验报告。
四、任务要求
1.实验结果准确可靠，数据分析到位。
2.实验报告结构严谨，内容充实，文字表达清晰。
3.实验过程中注意安全，遵守实验室管理规定。
4.完成实验时间为两个月。
五、参考文献
1.钱加森,周建国,孙颖,等.MHC类分子递呈机制研究进展[J].生命科学研究,2017,21(1):25-29.
2.江平平,王海娇,谢良基,等.鸡MHCⅡ类分子C基因重组质粒的构建及原核表达[J].中国农业科学,2010,43(5):943-950.
3.周娅欣,窦立荣,孙一丹,等.鸡抗体单克隆制备研究进展[J].农业生物技术学报,2013,21(2):228-236.