黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因克隆表达与定性的任务书.docx

黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因克隆表达与定性的任务书
任务书
一.任务背景和目的
黑曲霉α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）是一种重要的酶类，在糖分解和多糖降解中起到关键作用。它具有高效催化葡萄糖苷键断裂的能力，可以将葡萄糖苷分解成葡萄糖单体。因此，α-Glucosidase广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。目前，已经有很多研究发现许多真菌和细菌都可以产生α-Glucosidase，在这些中也包括了黑曲霉。
本次任务是对黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、表达和定性分析。其中，基因克隆和表达是本次研究的关键步骤。通过基因克隆得到纯净的重组蛋白后，接下来需要对其进行定性分析，以确定其特性和活性。
本次任务的目的是，通过对黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因进行克隆、表达和定性分析，获取黑曲霉α-葡萄糖苷酶纯净的重组蛋白样品，并探究其特性和活性，为进一步研究其应用提供基础。
二.任务内容和步骤
1.基因克隆
（1）从黑曲霉中提取总RNA，逆转录为cDNA模板。
（2）利用PCR技术，以黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的已知序列为模板，设计合适的引物，扩增出纯化和克隆所需的基因片段。
（3）将获得的PCR产物克隆到T载体中，转化到大肠杆菌（E.coli）中，进行筛选。
2.基因表达
（1）利用PCR扩增出含有黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的目的载体，如pET-22b，并进行重组。
（2）将重组的载体转化到大肠杆菌表达株中，并进行适当的诱导表达，以获得大量的重组蛋白。
（3）以高效的离子交换色谱法等技术，对含有重组蛋白的细菌发酵液进行纯化，得到黑曲霉α-葡萄糖苷酶纯净的重组蛋白样品。
3.定性分析
（1）利用SDS-PAGE等方法，对重组蛋白样品进行分子量和相对含量的检测。
（2）对纯净蛋白样品的活性进行检测，确定黑曲霉α-葡萄糖苷酶的底物特异性、反应动力学参数和酶学性质等。
（3）通过对重组蛋白结构和活性相关基因的生物信息分析，对黑曲霉α-葡萄糖苷酶的酶学特性进行探索。
三.研究方法和技术路线
1.基因克隆
（1）总RNA提取试剂盒（TransGenBio）进行RNA分离。
（2）PrimeScriptTMII一步RT-PCRkit(TaKaRa)用于逆转录和PCR扩增。
（3）T4DNAligase(NEB)用于连接PCR产物和载体。
（4）大肠杆菌DH5α进行质粒转化，遗传学操作按基本常规操作。
2.基因表达
（1）E.coli系统采用pET-22b载体，融合His标签，SpinchaserI等进行限制酶处理。
（2）利用Ni2+配体螯合树脂(HisTrap)进行柱层析。
3.定性分析
（1）SDS-PAGE分离和四氧化三钨法检测。
（2）柔性底物分析法（Flexassay），用于检测酶活性。
（3）SWISS-MODEL搭建三维结构，NCBIORFfinder推出相关CDS序列。
四.任务进度和计划
对于本次任务的进度计划如下：
1.基因克隆：15天
2.基因表达：20天
3.定性分析：20天
总计：55天
五.实验条件和需求
实验条件和需求如下：
1.实验室：本研究所在实验室。
2.仪器设备：PCR仪、电泳仪、大肠杆菌DH5α、E.coli表达株、柱层析设备、离心机等。
3.材料和试剂：总RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMII一步RT-PCRkit、利用Ni2+配体螯合树脂(HisTrap)等。
六.参考文献
1.李晓霞,刘仁娜,丁俊峰.黑曲霉聚糖酶的分离纯化及性质鉴定.食品与发酵工业,2014(13):1-6.
2.张继承,陈继华,张晓兰.黑曲霉葡萄糖苷酶基因的克隆与表达.生命科学仪器,2010,8(6):68-71.