青梅植酸酶phyA基因的克隆、表达及蛋白性质的改良的任务书.docx

青梅植酸酶phyA基因的克隆、表达及蛋白性质的改良的任务书
任务书
论文题目：青梅植酸酶phyA基因的克隆、表达及蛋白性质的改良
一、研究背景及意义
植酸是植物中广泛存在的一种磷酸化合物，它与植物蛋白质和营养元素之间形成结合，影响了人们的食品营养摄取和某些动物和家禽的消化吸收。青梅植酸酶phyA是一种分子量约为40kDa的植物酸性磷酸酶，能降解植酸，使其发挥营养价值。青梅植酸酶phyA的研究可以为食品加工业和饲料业提供新思路，开发新产品，增加其营养价值和经济价值。
二、研究内容
1.青梅植酸酶phyA基因的克隆
使用青梅组织提取总RNA，以RT-PCR方法克隆青梅植酸酶phyA基因全长序列，建立基因克隆库。
2.青梅植酸酶phyA基因的表达
对青梅植酸酶phyA基因进行原核表达，测定表达的最适温度和最适pH值。进一步，将青梅植酸酶phyA基因进行真核表达，测定表达的酶活力及特性，得出最适温度和最适pH值等数据。
3.青梅植酸酶phyA蛋白质性质的改良
通过点突变、酶活化剂和热处理等方法，改变青梅植酸酶phyA蛋白的结构和性质，测定酶活力、稳定性等性状的变化，研究对青梅植酸酶phyA酶活性和稳定性的影响。
三、研究方法
1.青梅组织RNA总提取，RT-PCR克隆青梅植酸酶phyA基因全长序列
2.静态培养法和搅拌培养法原核表达和纯化青梅植酸酶phyA蛋白
3.脂质体介导真核表达青梅植酸酶phyA蛋白及其酶活性的测定
4.对青梅植酸酶phyA点突变、热处理，添加酶活化剂等，测定其酶活力、稳定性的变化
五、研究进度安排
第一期：准备工作(1-2周)
主要完成：文献查阅，确定青梅植酸酶phyA基因克隆的PCR引物序列，制备所需实验材料。
第二期：青梅植酸酶phyA基因的克隆(3-4周)
主要完成：提取青梅细胞总RNA，扩增青梅植酸酶phyA基因全长序列，酶切、连接与质粒转化等。
第三期：原核表达青梅植酸酶phyA蛋白(4-5周)
主要完成：构建含有青梅植酸酶phyA基因的原核表达质粒，转化进Escherichiacoli不足表达表达和纯化青梅植酸酶phyA蛋白。
第四期：真核表达青梅植酸酶phyA蛋白(4-5周)
主要完成：构建含有青梅植酸酶phyA基因的真核表达质粒，转染到HEK293细胞之后，通过Westernblot和酶活性检测来确定青梅植酸酶phyA在真核细胞中的表达情况和酶活性。
第五期：青梅植酸酶phyA蛋白质的改良(3-4周)
主要完成：点突变、添加酶活化剂或进行热处理，测定青梅植酸酶phyA酶活性和稳定性等性状的变化。
第六期：数据分析与论文撰写(4-5周)
主要完成：处理实验数据，撰写硕士论文并进行论文答辩。
六、预期目标
通过克隆青梅植酸酶phyA基因，并进行原核表达和真核表达，结合对其蛋白质性质的改良，为青梅植物酸性磷酸酶在食品和饲料加工方面的应用提供一定的理论和技术支持，同时也可为其它类似酶的研究提供一定的参考。
七、参考文献
1.Zhi,Z.,Liu,X.,Teng,K.,etal.Cloning,expression,andcharacterizationofaphytasegenefromAspergillusficuumR24inPichiapastoris[J].JournalofMicrobiology&Biotechnology,2018,28(2):313-321.
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3.Lai,F.,Yang,C.,Li,B.,etal.AphytasegenefromBurkholderiacenocepaciaXY139anditsapplicationinthedevelopmentofanefficientexpressionsysteminPichiapastorisforphytaseproduction[J].WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,2017,33(2):1-10.