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镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究的任务书
任务书
题目：镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究
一、研究背景和意义
镉是一种普遍存在于环境中的重金属污染物，在矿产开采、冶炼、化肥制造等行业都有广泛应用。由于其极强的毒性和长期积累作用，已被列为国际公认的环境污染三大有害物之一。镉的摄入不仅会直接危害人体健康，还会通过食物链传递，对动物和植物造成严重的影响。鸡作为生物链中的一环，尤其是农业的养殖业，镉对其的毒性影响已经引起了广泛的注意。
肝脏作为人和动物体内最重要的解毒器官之一，也是镉的主要转化和代谢部位之一。然而，过量的镉摄入会导致肝脏受损，以凋亡为标志的细胞死亡是导致组织和器官损伤的主要原因。内质网(Endoplasmicreticulum,ER)应激是镉引起肝脏细胞凋亡的重要途径之一。
因此，本研究旨在探讨镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制，从分子生物学的角度，揭示镉对细胞分化、代谢和凋亡的影响，探索镉污染的肝脏损伤机制，为动物镉污染的风险评估提供新思路。
二、研究对象
鸡肝细胞
三、研究内容和方法
1.研究内容
（1）确定各浓度镉离子对鸡肝细胞凋亡率的影响，筛选出适宜的镉离子浓度范围。
（2）通过TUNEL荧光染色法和流式细胞术制备镉处理的鸡肝细胞质染色体片段（DNAladder），观察镉对鸡肝细胞的损伤和凋亡作用。
（3）采用Westernblotting技术和Real-timePCR技术检测镉处理后鸡肝细胞内质网应激信号通路中关键基因和蛋白表达水平的变化，包括GRP78、ATF6、XBP1、CHOP等，探究内质网应激途径在镉诱导鸡肝细胞凋亡中的作用。
2.研究方法
（1）细胞培养
采用原代培养的方法，从新鲜的鸡肝中取出肝细胞，通过离心等方法去除鸡肝组织中的红细胞和各种细胞碎片，将洗净的细胞构建于培养皿中，加入M-199培养基和10%新鲜的胎牛血清，保持在37℃、5%CO2环境下培养至80%～90%的细胞收获率。
（2）镉离子处理
将鸡肝细胞分为镉处理组和对照组，镉处理组分别加入镉离子，镉离子浓度为5、10、20、40、80μmol/L，处理时间为24h，对照组加入等量无镉的PBS溶液，同样在相同条件下处理时长。
（3）TUNEL荧光染色法
TUNEL法（TdT-mediateddUTPnick-endlabeling）是检测细胞凋亡的有效方法之一，通过对细胞核DNA末端标记和检测，可观测到细胞凋亡的程度。在镉处理鸡肝细胞的实验中，应用TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡程度。
（4）DNAladder
DNAladder是死亡的细胞内核DNA在凝胶电泳中显示特殊特征，我们可以用此方法检测细胞的凋亡指标。在镉处理鸡肝细胞的实验中，利用流式细胞术检测凋亡的细胞并制备DNAladder。
（5）Westernblotting技术
Westernblotting技术是分析蛋白质表达的重要方法。通过Westernblotting技术，我们检测镉处理后细胞复合物GRIP78、ATF6、XBP1和CHOP的蛋白表达，从而探讨镉诱导内质网应激通路，并研究其对鸡肝细胞凋亡的影响。
（6）Real-timePCR技术
Real-timePCR技术可以检测基因表达水平。在镉处理过后，我们采用Real-timePCR技术检测GRP78、ATF6、XBP1和CHOP的mRNA表达水平，为镉诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究提供基因表达的依据。
四、研究预期结果
我们希望通过镉经内质网应激途径诱导鸡肝细胞凋亡机制的研究，揭示镉对细胞分化、代谢和凋亡的影响，研究其在鸡肝细胞内质网应激信号通路中的作用，探索镉污染的肝脏损伤机制，为动物镉污染的风险评估提供新思路。
五、参考文献
1.L.Ding,C.Cao,W.Chen,etal.(2017).Cd-inducedROS-mediatedmitochondrialapoptoticpathwayinchickenrenaltubularcells.Oncotarget.8(53):91624–91632.
2.M.Konieczka,E.Rozpara,K.Lukaszewicz-Hussain.(2019).Themolecularmechanismofcadmiumtoxicity—affectingthecycleoflife,death,andsurvivalinplants.InternationalJournalofMolecularSciences.20(15):3649.
3.D.H.Lee,S.K.Kim,J.Y.Seo,etal.(2018).Fucoidanpreventscadmium-inducedacuteliverinjuryviainhibitionofERK