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氧化应激调控小鼠卵巢颗粒细胞Puma表达的机制研究的任务书
任务书
论题：氧化应激调控小鼠卵巢颗粒细胞Puma表达的机制研究
1.研究背景
卵巢颗粒细胞是卵泡中卵母细胞与环绕其的卵丘细胞之间的相互作用，它们的紧密联系可以保证卵子的正常成熟。Puma是一种负调控了细胞周期的蛋白，其表达水平和卵巢颗粒细胞的生长和凋亡相关。先前的研究表明，卵巢颗粒细胞受到氧化应激的影响可能会调节Puma的表达，从而影响其生长和生存。因此，深入地研究氧化应激对Puma表达的调节机制，能够为卵巢颗粒细胞的保护提供新思路，并为不孕症、卵巢功能障碍等相关疾病的研究提供理论依据。
2.研究任务
2.1确定氧化应激下卵巢颗粒细胞Puma的表达变化规律，分析影响其表达的主要因素。
将小鼠卵巢颗粒细胞分为正常对照组和氧化应激处理组，分别培养不同的时间，然后采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Westernblotting方法检测其Puma的表达水平，并分析氧化应激因素对其表达的影响，并筛选出主要影响因素。
2.2探究氧化应激下，Puma表达的调控机制，进一步明确其调节机制。
通过Westernblotting方法分析氧化应激下Puma的翻译后修饰及分解机制，同时进行免疫共沉淀和质谱分析，明确氧化应激对Puma表达的调节机制。
2.3研究Puma对卵巢颗粒细胞生存和凋亡的影响，阐明氧化应激下卵巢颗粒细胞生存机制的改变。
通过CCK-8细胞活力试验和TUNEL法检测氧化应激下Puma对卵巢颗粒细胞的生存和凋亡的影响，同时结合前面的结果探究氧化应激下卵巢颗粒细胞生存机制的变化。
3.研究方法
3.1细胞培养
将小鼠卵巢颗粒细胞分别培养在正常环境下作为对照组，和在氧化应激信号单独或联合作用下作为实验组，分别培养24小时和48小时，采集过程中按组分别存放。
3.2实时荧光定量PCR(qPCR)
用qPCR法检测PumamRNA表达的变化。采取Trizol法提取细胞总RNA，然后用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser逆转录，qPCR条件为：94℃2min，94℃20s，54~62℃30s，72℃45s，共40周期。计算出表达量，利用DNAMAN软件进行比较和分析。
3.3Westernblotting
用Westernblotting法检测Puma蛋白表达变化，并进行其翻译后修饰分析。使用各种抗体，如Pumamonoclonalantibody、GAPDHmonoclonalantibody等，Secondarantibody是HRP-goat-anti-mouse，检测方法采用colordevelopment，实验三次，取平均值。
3.4免疫共沉淀和质谱分析
采用免疫共沉淀技术，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂处理小鼠卵巢颗粒细胞，然后使用FLAG标记的抗体分别沉淀Puma蛋白和与其结合的其它物质。采用MALDI-TOF质谱技术分析免疫共沉淀的产物。
3.5CCK-8试验
采用CCK-8方法检测Puma对卵巢颗粒细胞的影响。实验分为对照组和实验组，每组加入0.1mlCCK-8溶液，光密度测定其吸收率。
3.6TUNEL法
采用TUNEL法检测氧化应激下Puma对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。用共聚焦显微镜观察细胞凋亡程度，优化实验条件并获得影像。
4.研究预期成果
通过以上研究方法，可以得到卵巢颗粒细胞在氧化应激下Puma表达的变化规律，并初步探究其调节机制，并明确Puma在卵巢颗粒细胞生存和凋亡中的作用，从而进一步阐明了氧化应激对卵巢颗粒细胞机制调节的影响。这些结果有望为卵巢颗粒细胞保护、不孕症、卵巢功能障碍等相关疾病的治疗提供新思路。