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酿酒酵母中构建T7持续表达系统的初步研究的任务书
任务书
一、研究背景
酿酒酵母是一种常见的真菌，被广泛应用于酿造和面包制作等生产领域。随着分子生物学和基因工程技术的发展，酿酒酵母已成为一种理想的模式生物，被广泛应用于生命科学研究领域。在酿酒酵母中，T7RNA聚合酶（T7RNApolymerase）能够提供高效、特异性的转录作用，因此常被用于构建表达外源基因的载体。但T7RNA聚合酶只在细菌中表达，因此需要构建T7RNA聚合酶在酿酒酵母中的持续表达系统，以便于对基因的快速高效表达。本研究旨在构建T7RNA聚合酶在酿酒酵母中的持续表达系统，并进一步应用于外源基因的高效表达和功能研究。
二、研究内容
1.构建T7RNA聚合酶在酿酒酵母中的持续表达系统。
（1）筛选合适的启动子和终止子，用于驱动T7RNA聚合酶的表达。
（2）构建T7RNA聚合酶的CDS序列，设计克隆引物。
（3）利用酿酒酵母基因转染技术将T7RNA聚合酶插入酵母基因组中，构建T7RNA聚合酶在酿酒酵母中的持续表达系统。
2.验证持续表达系统的表达效率和稳定性。
（1）采用荧光素酶报告基因（luciferase）确定T7RNA聚合酶的表达水平。
（2）用Westernblotting方法检测T7RNA聚合酶的蛋白表达水平。
（3）通过荧光显微镜观察表达效果。
（4）持续监测持续表达系统的表达水平。
3.应用持续表达系统进行外源基因的高效表达。
（1）将目标基因插入到T7RNA聚合酶的下游，利用持续表达系统高效表达外源基因。
（2）应用Westernblotting方法检测外源基因的表达效果。
（3）应用功能分析方法验证外源基因在酿酒酵母中的活性。
三、研究计划和进度安排
本研究计划总时长为12个月，计划如下：
第一阶段：T7RNA聚合酶持续表达系统构建（2个月）
月份工作内容完成情况
1设计PCR引物；筛选启动子、终止子；检测酿酒酵母基因转染方法已完成PCR引物设计；已筛选启动子、终止子；已检测酿酒酵母基因转染方法；
2克隆T7RNA聚合酶的CDS序列到构建的载体中；酵母基因转染T7RNA聚合酶的CDS序列已克隆到构建的载体中；已进行酵母基因转染；
第二阶段：持续表达系统表达效率和稳定性的验证（4个月）
月份工作内容完成情况
3采用荧光素酶报告基因确定T7RNA聚合酶的表达水平；利用Westernblotting方法检测表达水平已完成荧光素酶报告基因的测定；已进行Westernblotting检测
4通过荧光显微镜观察表达效果；持续监测持续表达系统的表达水平已完成荧光显微镜观察；已进行持续监测表达水平；
5结果分析和总结已完成表达水平的分析和总结
第三阶段：持续表达系统应用于外源基因的高效表达（4个月）
月份工作内容完成情况
6将目标基因插入到T7RNA聚合酶的下游；制备重组蛋白目标基因已插入到T7RNA聚合酶的下游；已制备重组蛋白
7应用Westernblotting方法检测表达效果已进行表达效果检测；
8应用功能分析方法验证外源基因在酿酒酵母中的活性已进行外源基因在酿酒酵母中的活性验证
第四阶段：研究总结和论文撰写（2个月）
月份工作内容完成情况
9研究结果总结撰写已完成研究结果的总结
10论文撰写论文写作进度已完成50%
11论文撰写论文写作进度已完成70%
12论文撰写、论文修改和提交论文已修改和提交
四、研究经费预算
本研究预计需要经费50万元，其中包括实验耗材、设备维护、人员工资、论文发表等开支。
五、参考文献
1.YanR,HuoZ,YinH,etal.Precisegenomeengineeringineukaryotesviahomology-directedrepair.NaturereviewsMolecularcellbiology,2015,17(4):217-227.
2.LiuZ,TyoKE.ImprovingproteinproductioninSaccharomycescerevisiaebyproteindamination.Biotechnologyjournal,2015,10(12):1967-1973.
3.ElledgeSJ,DavisRW.PositionandefficiencyoftheT7RNApolymerasepromoter-transcriptioninitiationsitesequenceinEscherichiacoliDNA.Cell,1989,56(4):601-611.