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鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其免疫生物学特性初步研究的任务书
任务书：鸡白痢沙门菌△fur△speDE的构建及其免疫生物学特性初步研究
1.项目背景和意义
鸡白痢是由沙门菌所致的鸟类肠道疾病，其传染性极强，严重威胁着家禽养殖业的可持续发展和动物的生产安全。因此，为了防止和控制鸡白痢的发生和传播，对其在分子生物学、免疫学等方面的研究成为当前热门的研究领域之一。近年来，基因操作技术的出现为我们提供了一种新的思路：从基因水平上去研究沙门菌致病机制和疫苗研制，也为我们开展沙门菌基因的删减和构建提供了条件。本研究将构建鸡白痢沙门菌△fur△speDE菌株，并进一步探究其在免疫生物学方面的特性，以期为鸡白痢的防控提供一种新的解决方案。
2.研究内容和目标
本研究将基于广谱宿主依赖性质粒pKD46实现鸡白痢沙门菌基因组上ferricuptakeregulator(fur)、salmonellapathogenicityisland1effectors(speDE)的定向基因删减，构建鸡白痢沙门菌△fur△speDE菌株，并进一步探究其在免疫生物学方面的特性。具体包括以下内容：
（1）DNA片段设计与实验室构建。通过基因芯片检测法，选择发现鸡白痢沙门菌内在特异性、功能性强、易归因等特征的fur、speDE基因片段，设计引物扩增和测序验证。基于PCR重叠扩增技术，在pKD46载体上构建fur、speDE删减系统，激活红莑色素基因来实现诱导。
（2）获得宿主相关菌株。本研究拟选用半鸡梗杆菌、大肠杆菌等细菌作为鸡白痢沙门菌构建的宿主，需提前对所选宿主细菌进行特性筛选和体外培养等步骤。选取适宜生长并能够提供丰富养分的杆菌，进行宿主细胞转化实验，在不同的培养基系统中进行诱导试验。
（3）验证其遗传改造。根据PCR扩增和测序结果，在已经构建的菌株中进行基因检测，比对初步评估构建结果的质量和可信度，结合凝胶电泳等技术验证，证实其基因组质粒构建成功。
（4）评价其免疫生物学特性。通过淋巴细胞移位实验、ELISA免疫检测、自主繁殖等方式，对鸡白痢沙门菌构建菌株△fur△speDE的免疫生物学特性进行初步评价，为疫苗的开发提供理论依据和实验参考。
3.研究方法和技术路线
（1）DNA片段设计与实验室构建。参考鸡白痢沙门菌基因序列信息，通过基因芯片法筛选可能具有功能性的基因段，并在此基础上进行引物设计和扩增实验，可选用TaqDNApolymerase等PCR扩增方法。设计并合成适配器序列，插入到质粒载体pKD46T等上。构建范畴是将含穿膜结构的speDE基因替换后，pKD46T自带的荧光素酶基因即可表达正常向下调控基因的功能性。
（2）获得宿主相关菌株。选择半鸡梗杆菌和大肠杆菌等作为常见的沙门菌宿主，实验室培养菌株并进行对比实验，筛选出生长状况最优且有利于试验进行的细菌。
（3）定向基因删减和构建的步骤为：a)构建fur删减的操作步骤包括：利用red辅助重组技术将pKD46-T和pKD13共转化到宿主细胞中，并诱导桥接的DNA片段发生重组，通过PCR和测序检验所设计删减基因的成功；b)利用类似的步骤构建speDE删减，将拉格氏负青杆菌投入光明和黑暗环境，检测相应的基因表达。构建后的鸡白痢沙门菌△fur△speDE菌株应使用PCR方法鉴定。
（4）评价其免疫生物学特性。利用淋巴细胞移位实验验证新构建菌株是否可以激活单核/巨细胞，使用ELISA或者Westernblot分析新构建表型对免疫系统的应答性，采用invitro神经细胞细胞培养来检测菌株是否可以减少沙门氏菌的毒性，通过活体实验验证菌株的传染性和致病性差异等方法对构建的菌株进行评价。
4.研究进展和预期成果
当前，本研究已经完成fur、speDE基因片段的设计和引物扩增实验，还进行了基因序列的测序和比对，预计一个月内完成基因组删减构建。随着实验的正式进行，我们将逐步掌握新构建菌株在免疫生物学方面的特性，达到在免疫疫苗研究领域中帮助探讨鸡白痢沙门菌的致病机制和疾病防控的目标。期待本研究将对鸡白痢的预防和治疗有所帮助，为我国家禽养殖业的可持续发展做出贡献。