水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测.doc

水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1)
录入时间:2０10—９-251１:17:29来源：生物信息网
(一)实验目的
（1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(２）学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
（３)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法.
(二）实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有:水中的水生性微生物(如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验,特别是肠道细菌的检验,在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定,饮用水中大肠菌群数每升中不超过３个，细菌总数每mL不超过1０0个。
所谓细菌总数是指1mL或１g检样中所含细菌菌落的总数,所用的方法是稀释平板计数法,由于计算的是平板上形成的菌落（cｏlony—forｍingｕnit,cfu)数，故其单位应是cｆu/g（mL)。它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在３7℃2４h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指10０ｍL水检样内含有的大肠菌群实际数值,以大肠菌群最近似数(MPN)表示.在正常情况下,肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源,由于大肠菌群在肠道内数量最多,所以,水源中大肠菌群的数量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前,国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标．因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样.
（三）实验器材
(1）菌落总数的测定:
1）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,无菌生理盐水。
２）器材：灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿，灭菌吸管,灭菌试管等。
(2）大肠菌群的测定;
1)培养基：
①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
蛋白胨20g,猪胆盐（或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mＬ,水１０00mL,pH7。4.
制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pＨ,加入指示剂，分装,每瓶50mＬ或每管５mＬ，，并倒置放入一个杜氏小管,ｌ15℃灭菌15min.
双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基:除水以外,其余成分加倍或取三倍用量。
②伊红美蓝琼脂培养基:
蛋白胨10g，乳糖１0ｇ，K２ＨP042ｇ,2％伊红水溶液２０Ml，0.6５%美蓝水溶液lOmＬ,琼脂17g，水1000mL，ｐH7.1。
制法:将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．１２1℃灭菌15min备用．临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至５0-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀，倾注平板。
③乳糖发酵管：
除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。
2）器材:灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四）实验方法
(1）水样的采集:
1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流５ｍin,以灭菌三角瓶接取水样以备分析.
2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边５m处，取距水面１0-15ｃm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存．
(2)细菌总数的测定:
１）水样稀释及培养:
①按无菌操作法，将水样作１0倍系列稀释:
⑦根据对水样污染情况的估计，选择２-３个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择１、1:10两种浓度；水源水如河水等,比较清洁的可选择１:10、1：1００、１：1000三种稀释度；污染水－被选择1：1０0、1:100０、1：1００00三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作３个重复.
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养２4±１h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数，即得１ｍＬ水样中所含的细菌菌落总数。
２)计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察,必要时用放大镜检查，以防遗漏.在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数．
3）计数的报告：
①平板菌落数的选择：
选取菌落数在30—３００之间的平板作为菌落总数测定标准