FCM原理及临床应用-重医.ppt

流式细胞术(flowcytometryFCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。FCM的工作原理

1.液流系统：由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。
鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液
作用：
1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；
2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。
激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。
检测信号：散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。FCM检测信号荧光信号3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。
通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析
存储、显示。
具有智能化、自动化特点。
免疫荧光标记常用免疫荧光染料组合荧光补偿：
每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。流式细胞仪的基本功能
细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析
DNA含量及细胞周期分析：DNAcontentanalysis，如细胞凋亡检测

细胞分选cellsorting
自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如用Hep-2细胞检测抗核抗体。临床免疫学
临床血液学
临床肿瘤学
血栓与止血
骨髓和器官移植
基础医学研究FCM在临床免疫学中的应用

(1)淋巴细胞亚群分析
T细胞：CD3+
CD4+(Th)
CD8+(Ts/Tc)
B细胞：CD19+
NK细胞：CD3-CD16+CD56+(2)淋巴细胞亚群细分
T细胞：Ts：CD8+CD28-
Tc：CD8+CD28+
Th：CD4+CD29+

B细胞：B1：CD5+CD19-
B2：CD5+CD19+根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为
CD4+:
Th1:CD4+IFN-r+
Th2:CD4+IL4+
Th0:CD4+IFN-r+IL4+
CD8+:
Tc1:CD8+IFN-r+
Tc2:CD8+IL4+
Tc0:CD8+IFN-r+IL4+

辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义
Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。
Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。(3)活化淋巴细胞亚群
活化总T细胞：CD3+/HLA—DR+
静止总T细胞：CD3+/HLA—DR-
活化CD4+细胞：CD4+/HLA—DR+
活化CD8+细胞：CD8+/HLA—DR+
活化诱导分子：CD69
白细胞介素2低亲和力受体：CD25
CD25+/CD3+：活化T细胞
CD25-/CD3+：静止T细胞(4)淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞因子的测定
自身免疫性疾病
变态反应性疾病
免疫缺陷性疾病
感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染)
免疫治疗监测
肿瘤免疫监测
移植免疫监测(二)FCM在临床血液学中的应用

1.白血病的MIC分型
Morphology（形态学）
Immunology（免疫学）
Cytogenetics（细胞遗传学）
白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。免疫分型的临床意义
以下为各系列较特别的标志：
AML：MPO、CD33、CDl3、CDl4CDl5、CDllb、CDllc
T-ALL：c／mCD3、CD2、CD5、CD7、CD4／CD8、CD38
B-ALL：cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLA—DR、CD20、
CD38
造血干／祖细胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33
在AML各亚型的免疫分型中有时仍较难分辨，有以下特点可供参考：
①CD41、CD61是巨核细胞的标志，见于FAB—M7，但血小板粘附于某细胞上可造成假阳性。
②CD71与血型糖蛋白是红系的标志，见于FAB—M6型。
③CDl4、CD64是单核细胞的标志，见于M4或M5。
④FAB—M3，t(15；17)者典型的免