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猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及自噬对病毒增殖影响的开题报告
摘要
猪流行性腹泻病毒是一种高度致命的病毒，能够引起猪的严重腹泻，导致经济严重损失。在本研究中，我们采用病毒学、生物学及免疫学等方法，分离鉴定猪流行性腹泻病毒流行株，并研究自噬对病毒增殖的影响。研究结果表明，我们成功分离纯化了猪流行性腹泻病毒流行株，并确认其基因组序列。此外，我们还研究了自噬在病毒增殖中的作用，结果发现，自噬能够抑制病毒增殖。本研究为猪流行性腹泻病的防控提供了新的思路和理论基础。
关键词：猪流行性腹泻病毒；自噬；病毒增殖
引言
猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是一种单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。这种病毒在全球广泛存在，尤以亚洲、欧洲和北美洲地区为多。该病毒能够引起猪的严重腹泻，导致经济严重损失。研究表明，猪流行性腹泻病毒通过肠道系统传播，病原体定位在小肠上皮细胞，引起小肠上皮细胞脱落和小肠壁水肿，病理变化严重。目前，目前对于PEDV的研究仍处于初步阶段，对于PEDV的防控仍有很大的挑战。因此，分离鉴定PEDV的流行株以及探究PEDV的生物学特性，对于PEDV的防控具有重要的意义。
自噬是指细胞将一部分的细胞质或细胞器包裹成一个囊泡（自噬体）然后转运到溶酶体内消化降解的一种细胞代谢现象。过去几十年里，越来越多的研究表明，自噬在细胞代谢、细胞应激、细胞增殖以及免疫应答等方面发挥着重要的作用。而对于病毒感染和增殖，自噬也具有不同程度的调控作用。研究表明，自噬能够降低一些病毒的繁殖（如HIV、HCV等），并能够抵御一些病毒的感染（如HSV、CMV、EBV等）。
本研究的主要目的是分离鉴定PEDV的流行株，并研究自噬对PEDV的增殖作用。
材料和方法
病毒细胞培养
我们从血清中分离提取PEDVRNA，并将PEDVRNA通过逆转录PCR扩增为cDNA。将PDVcDNA克隆于真核细胞表达载体pEGFP-N1上。随后，我们选用293T细胞作为目标细胞，将表达PEDVcDNA的载体转染至293T细胞，并使用光学显微镜观察PEDV在293T细胞中的增殖情况。
PEDV病毒鉴定
我们采用荧光倒置显微镜观察PEDV在293T细胞中的增殖情况。同时，收集样本，提取RNA后通过RT-PCR检测并确定其基因组配列。最后，我们使用电镜观察PEDV的形态特征和病理学特征，以确保PEDV的纯度和活性。
自噬特性检测
我们在PEDV感染的293T细胞中引入自噬特征标记物GFP-LC3，并采用荧光显微镜观察PEDV感染的293T细胞中自噬的程度。同时，我们使用Si-RNA干扰法抑制自噬的形成，并观察PEDV繁殖株在Si-RNA处理的293T细胞中的生长情况。
结果分析
我们成功分离纯化了猪流行性腹泻病毒流行株，并进行了基因组配列的确定。病理学分析发现，PEDV在293T细胞中增殖良好。电镜观察发现，PEDV颗粒直径约为50-200nm之间，呈现出圆形或椭圆形，表面带有具有棘状突起形态的膜。
针对PEDV与自噬之间的关系，我们发现PEDV感染后会诱导细胞自噬的产生，并且自噬体的数量会随着PEDV感染的时间延长而增加。同时，我们发现通过Si-RNA处理能够抑制PEDV感染株的生长，表明自噬对PEDV的繁殖具有负调控作用。
结论
本研究通过病毒学、生物学及免疫学等方法，成功分离纯化了PEDV，并对其进行了基因组配列的测定。同时，本研究还研究了PEDV与细胞自噬之间的关系，结果表明自噬能够负调控PEDV的增殖。研究结果为PEDV的防控提供了重要的理论基础。