利用RAPD和ISSR技术对13个观赏桃品种的遗传多样性分析的任务书.docx

利用RAPD和ISSR技术对13个观赏桃品种的遗传多样性分析的任务书
一、研究背景
随着人们对优质观赏植物的需求不断增加，种植业也在不断地向多样化、高效化的趋势发展。观赏桃属于漆树科植物，是一种常见且广泛应用的园林植物，以其优美的姿态、丰富的花色、艳丽的花期、浓郁的香味和频繁的开花、换叶等性状成为广大园艺爱好者喜爱的植物。目前，国内外已经发展出一系列优良的品种。了解不同品种之间的遗传多样性和亲缘关系，对于优化品种的配对、选育和培育有着重要的意义。
RAPD（随机扩增多态性DNA）和ISSR（内部转录间隔区重复序列）是两种广泛应用的分子遗传学技术，在种质资源鉴定、品种鉴定、遗传多样性分析等领域有着广泛的应用。利用这两种分子遗传学技术可以对观赏桃品种的遗传多样性进行评估和揭示亲缘关系，为观赏桃的选育和繁殖提供科学依据。
二、研究目的
本研究旨在利用RAPD和ISSR技术对13个观赏桃品种的遗传多样性进行分析和评估，揭示不同品种之间的亲缘关系和分类学群体结构。具体研究目的如下：
1.通过RAPD和ISSR技术评估13个观赏桃品种的遗传多样性水平，并比较两种技术的效果优劣；
2.构建13个品种的遗传相似性矩阵，进行群落分析和聚类分析，探究不同品种之间的亲缘关系；
3.探究RAPD和ISSR技术在观赏桃遗传多样性分析中的优缺点，为提高分子遗传学技术的应用效率和精度提供参考。
三、研究内容
1.样品的处理和DNA提取
收集13个观赏桃品种的新鲜嫩叶，将其浸泡在液氮中，然后使用粉碎器粉碎为细碎的粉末，并将粉末转移到2mL离心管中。DNA提取采用CTAB法，将上述粉末样品加入500μLCTAB提取液中，经过室温下孵育后，加入等体积的氯仿/异戊醇进行分离，洗涤后加入无水乙醇沉淀DNA，最后使用蒸馏水重悬。
2.RAPD技术优化和操作
基于先前文献和外部试剂，优化RAPD反应体系，包括模板DNA在反应总体积中的质量浓度、引物浓度和体积、反应温度和时间等因素，以获得最佳的扩增效果。扩增反应中，将DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、缺失nuclease自由水分别混合，分别加入PCR管中。反应条件为：95°C预变性5min，16个循环的94°C变性30s、45°C退火45s和72°C扩增45s，最终延伸72°C10min。
3.ISSR技术优化和操作
ISSR扩增反应体系的优化也是必要的。优化考虑到的因素有：模板DNA浓度、引物混合比例和体积、PCR反应体积等。ISSR扩增反应的热循环条件为：95°C预变性5min，35次循环的94°C变性30秒、50°C退火30秒和72°C扩增1min，最后延伸72°C8min。
4.RAPD和ISSR扩增产物的电泳分析
扩增产物的电泳分析分为两部分，一部分为RAPD扩增产物的电泳分析，另一部分为ISSR扩增产物的电泳分析。首先，将反应产生的PCR产物加入等体积的浓度的堆胶缓冲液中，混合后添加至凝胶孔中定向电泳。电泳条件为：电压140V，电流300mA，电泳时间约60min。随后，使用软件对电泳带进行处理和分析，并用于构建遗传距离矩阵。
5.遗传多样性分析与数据处理
使用POPGENE软件分析不同品种之间的遗传距离和多样性指数，并利用UPGMA法对物种进行进化树聚类分析，红色树软件进行分子方差分析（AMOVA）。最后，利用SPSS软件进行遗传多样性分析和主成分分析（PCA）。
四、研究意义
本研究利用RAPD和ISSR技术对13个观赏桃品种的遗传多样性进行评价和分析，具有如下主要意义：
1.通过RAPD和ISSR分子标记的遗传多态性信息，构建了观赏桃的遗传相似性聚类分析，并揭示了不同品种之间的亲缘关系，为下一步观赏桃的遗传育种提供指导；
2.评估RAPD和ISSR技术在观赏桃遗传多样性分析中的效果，分析两种技术的优缺点，为提高种质资源的快速、简便、准确评价提供了指导。
五、研究进度安排
本研究的时间预计为3个月。各项任务的详细进度安排如下：
第1-2周：收集13个观赏桃品种的材料，进行样品处理和DNA提取；
第3-4周：优化RAPD和ISSR反应条件降低非特异性扩增；
第5-7周：独立进行RAPD和ISSR扩增试验，并进行扩增产物的电泳分析；
第8-9周：用软件分析RAPD和ISSR扩增产物的分析结果，并比较不同品种之间的遗传多样性水平；
第10-11周：进行聚类分析和主成分分析（PCA）；
第12-13周：总结分析结果，编写论文，最后完成试验。