兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立的任务书.docx

兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立的任务书
任务书
一、任务背景
兔支气管败血症（RabbitRespiratoryInfection,RRI）是一种由波氏杆菌感染引发的兔靶器官病。病原体为兔支气管败血波氏杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、兔肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）和卡他莫拉菌（Chlamydiapsittaci）。其中，兔支气管败血波氏杆菌是兔支气管败血症的主要病原体之一，经常引发支气管和肺部感染、败血症、休克等严重疾病，影响养兔业发展，造成经济损失。因此，建立准确、快速、可靠的兔支气管败血波氏杆菌诊断方法对于防治兔支气管败血症具有重要意义。
目前，对于兔支气管败血波氏杆菌的检测方法主要包括细菌学培养、传统PCR检测、实时荧光PCR检测和ELISA检测等，但这些方法都存在着复杂、耗时、技术难度高等问题。所以，有必要研究快速检测方法来替代传统的检测方式。
二、任务目的
本研究的目的是利用分子生物学技术，克隆兔支气管败血波氏杆菌fimN基因，并构建快速检测方法。
三、任务内容
1.采用PCR技术从兔支气管败血波氏杆菌中扩增fimN基因，构建真核表达载体，将其转入真核表达宿主细胞中，表达优化条件；
2.建立PCR技术检测兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的快速检测方法，优化检测参数，包括PCR体系的组成、反应温度和时间等条件，以及检测灵敏度、特异性、重复性评价等；
3.开发可快速检测兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的实时荧光PCR检测方法，评价其灵敏度、特异性和重复性等参数；
4.采用病原体中的fimN基因为靶点，建立酶联免疫吸附检测（ELISA）方法快速检测兔支气管败血波氏杆菌，并优化检测参数；
5.对建立的三种方法（PCR、实时荧光PCR、ELISA）进行比较评估，确定其优缺点，选择最适合应用于临床检测和实际生产中的最佳检测方法。
四、技术路线和研究计划
1.技术路线
（1）克隆fimN基因并构建真核表达载体
1.1基因扩增：采取实验室保存的兔支气管败血波氏杆菌，提取其基因组DNA，利用PCR技术扩增fimN基因。
1.2DNA克隆：将扩增得到的fimN基因片段克隆入真核表达载体中。
（2）建立PCR技术检测fimN基因的快速检测方法
2.1优化PCR技术体系：设计引物、优化反应温度和时间等条件，建立PCR体系。
2.2评估PCR技术的灵敏度、特异性、重复性。
（3）开发实时荧光PCR检测兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的方法
3.1设计引物和探针，优化反应条件，建立实时荧光PCR体系。
3.2评估实时荧光PCR技术的灵敏度、特异性、重复性等参数。
（4）开发酶联免疫吸附检测（ELISA）方法
4.1克隆fimN基因的DNA序列，表达纯化重组蛋白。
4.2建立ELISA检测体系，优化反应条件。
（5）比较评估三种方法并选择最佳检测方法
5.1对PCR、实时荧光PCR、ELISA三种方法进行性能比较评估，并确定其优缺点。
5.2选择最佳的兔支气管败血波氏杆菌检测方法。
2.研究计划
（1）第一年：克隆fimN基因并构建真核表达载体。
（2）第二年：建立PCR技术检测fimN基因的快速检测方法，优化检测参数。
（3）第三年：开发实时荧光PCR检测兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的方法，评估其灵敏度，特异性和重复性。
（4）第四年：开发检测兔支气管败血波氏杆菌的酶联免疫吸附检测（ELISA）方法，评估其灵敏度、特异性和重复性。
（5）第五年：比较评估三种方法并选择最佳检测方法。
五、预期成果
1.克隆得到兔支气管败血波氏杆菌fimN基因。
2.建立PCR技术检测fimN基因的快速检测方法，评估其灵敏度、特异性和重复性。
3.开发实时荧光PCR检测兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的方法，评估其灵敏度、特异性和重复性。
4.开发兔支气管败血波氏杆菌的酶联免疫吸附检测（ELISA）方法，并评估其灵敏度。特异性和重复性。
5.比较评估PCR、实时荧光PCR和ELISA三种方法，确定最适合临床检测和实际生产中的最佳检测方法。
六、参考文献
1.LiuY,LiY,LiuX,etal.IdentificationofanovelhemophoreinPseudomonasaeruginosa[J].JournalofBacteriology,2015,197(5):924-933.
2.HajjarAM,ErnstRK,TsaiJH,etal.HumanizedTLR4/MD-2micerevealLPSrecognitiondifferentiallyimpactssusceptibilitytoSalmonellaTyphiandEnteritidis[J].PL