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水环境中两种典型致病微生物核酸检测方法的研究的开题报告
一、选题背景
据《中国环境保护部公报(2019年第4期)》显示，全国地表水平均优良比为62.6%，水体总磷、总氮和氨氮企稳趋势显著，饮用水质量达标率达到96.7%。但是，水环境中的微生物污染对人类健康产生了重要影响。并且，随着科技的发展，人们对微生物污染的识别和监测能力也在不断提升。本文将探究水环境中的两种常见致病微生物——大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的核酸检测方法。
二、选题意义
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都是水环境中微生物污染的典型代表。大肠杆菌对于水源的污染是一项重要指标，因为大肠杆菌在肠道中存在且难以杀灭，都是含有吸水、排泄功能的动物的肠道内正常菌群的一部分。因此，大肠杆菌可以成为预测水环境质量变化及卫生保健效果的指标。金黄色葡萄球菌是一种引起食物中毒和眼/耳感染的厌氧菌。因此，开发高效的核酸检测方法，能够及时、准确地检测水环境中的细菌污染情况，并采取相应的防治措施，保障人民健康。
三、研究内容
（1）大肠杆菌核酸检测方法研究
PCR法：PCR技术通过扩增目标DNA序列，达到检测靶标物的数量和特异性分析的效果，应用较为广泛且常规实验室可实现。目前，通过引入不同提示系统，PCR方法的灵敏度得到了极大提高。但是，PCR技术需要检测特异的DNA序列，因此需要确定靶序列，对检测不同毒性菌株和多种细菌的临床标本设计靶序列存在困难。此外，PCR方法存在交叉对引物和获得假阳性结果的危险。如：污染样本，DNA降解等也能影响PCR结果的准确性。
（2）金黄色葡萄球菌核酸检测方法研究
实时荧光定量PCR法：该方法不同于常规PCR，通过添加荧光探针监测反应过程中荧光的强度变化，从而定量分析RNA/DNA的数量。相比普通PCR，该技术具有定量和检测灵敏度高、无需分离扩增产物、反应时间短、扩增过程中无需泳动凝胶的特点。反应灵敏度可达到1拷贝/μL，只需数个小时从样品中检测到极少，这种方法耗时短，适用性高，而且可以进行定量检测，大大提升了实时监测和鉴定金黄色葡萄球菌的能力。但在核酸提取过程中，易受到植物残留物、黏液蛋白、微生物等对方法的影响。
四、研究方法
（1）核酸提取：PCR和实时荧光定量PCR技术都需要用到核酸提取步骤。核酸提取方法可以采用传统的酚-氯仿提取方法或者商用试剂盒进行核酸提取。
（2）PCR和实时荧光定量PCR：选取适当浓度的DNA模板及TG-HJ，TG-HAJ等特异性核酸引物，合适的荧光标记的探针，一定浓度的酶和反应缓冲液，设定PCR反应体系，通过扩增目标DNA序列，分别进行PCR和实时荧光定量PCR实验，比对样品。
（3）数据分析：根据实验结果分析不同核酸检测方法的检测灵敏度、特异性、速度、准确性等指标，并比较不同方法的优缺点，同时对应不同样品类型的核酸检测的操作流程和实验注意点。
五、预期成果
研究可提供较精确的方法来定量水环境中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存在情况，为潜在危险的水源和饮用水源保障人民健康。同时也可为开发更高效、精准、快速的水环境微生物检测技术提供借鉴。
六、研究意义
本研究将为研究者和实际应用者提供最新的技术发展方向和方法选择，为在微生物检测方面的技术创新提供思路和基础，并为环境监控部门提供新技术和方法，为了解水环境低水平的污染状况和推广核酸检测技术提供有力支撑。