Mcc950对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞损伤的保护作用的开题报告.docx

Mcc950对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞损伤的保护作用的开题报告
背景
糖尿病是目前全球公认的具有高发性和危害性的代谢性疾病，其中著名并发症之一便是糖尿病视网膜病变（DR）[1]。DR是糖尿病患者中最常见的眼病，并且在西方世界是失明的主要原因之一[2]。DR主要表现为微血管和视网膜血管内皮细胞损害导致的视网膜水肿、血管新生和再生（增生期DR）、视网膜脱离等病程进程，其中，视网膜内皮细胞（RECs）是视网膜微循环通路中的核心组分之一，且是DR病变过程中的优先受损细胞，其损伤会导致血管及其他细胞损伤和破坏[3]。
当前DR研究中，大量研究的基础是高糖所引起的视网膜损伤模型，研究发现，糖尿病患者的视网膜内皮细胞功能受损伤而不能及时修复，是导致DR病程进展的重要原因[4]。在这种状态下，内皮细胞代谢失调和线粒体功能异常活性氧（ROS）的释放增多，在细胞内造成炎症反应和氧化应激进而形成微血管炎症状态，使视网膜毛细血管受到严重损伤。很显然，对于DR的治疗研究，寻找一种能够抵御内皮细胞受损伤的药物药物是十分必要的。
MCC950作为炎症体外控制分子NLRP3的抑制剂，已经被证实在小鼠上能够抑制NLRP3感受器引发的糖尿病心肌病变。之前的研究已经证明MCCC950在缓解因为NLRP3炎症体引发的内皮细胞炎症状态[5]。由此，本次研究旨在寻找出MCCC950是否可以在高糖模型下保护视网膜血管内皮细胞损伤，为DR药物开发提供理论依据。
材料与方法
实验室常用离体培养人视网膜内皮细胞，并以高糖（30mM）和低糖（5mM）培养基分别培养内皮细胞。其中高糖培养基下的细胞用于模拟DR状态，制备DR模型。方法流程如下：
（1）买入细胞荧光素检测试剂盒（CCK-8），用此试剂查看细胞活性。
（2）同等细胞密度的内皮细胞分别了低糖和高糖培养基中培养24h，其中高糖组设置DR模型显微镜下查看细胞形态和表型是否发生变化。
（3）为寻找MCC950对内皮细胞的保护作用，将内皮细胞划分为以下几组：正常对照组、高糖模型组、高糖加15umol/L，3倍治疗组和10倍治疗组MCC950处理组，分别培养24hours。其中，高糖组为正常对照组，而低糖组为糖尿病模型组。
（4）将细胞取出，重新加入100μL的低糖培养基和10μLCCK-8试剂，共培养2小时。以450nm波长读取并记录OD450值。
（5）检测ROS和MDA含量：将培养的高糖模型细胞分别加入15μmol/L，3倍和10倍浓度的MCC950，处理24h后，取细胞抽提液和蛋白质样本液，通过ELISA将MDA和ROS浓度定量检测，且检测其在细胞内的表达情况。
（6）检测细胞凋亡情况：采用AnnexinV-FITC和PI染色。
结果
（1）高糖培养基的内皮细胞合理增加细胞体积，细胞状态变差，明显增加细胞凋亡比例，细胞保护作用降低。
（2）MCC950能有效提高内皮细胞的活性，以及降低ROS和MDA浓度。
（3）将细胞划分为5个组别：正常对照组、高糖模型组、高糖加15umol/L，3倍治疗组和10倍治疗组MCC950处理组，各组内根据荧光素检测试剂盒测定得到的细胞的OD450比值，经过比较研究，得到的研究结论表明，MCC950可通过降低内皮细胞ROS的水平，保护视网膜血管内皮细胞。
（4）平行于上面实验过程中，CCK-8试剂和AnnexinV/PI染色同时进行。AnnexinV/PI染色结果表明，MCC950可以有效降低高糖培养基下细胞凋亡比例。
讨论
对于视网膜血管内皮细胞的损伤，MCC950能够有效的进行抵御。本研究结果和之前的研究结果一样，MCC950对于人体内细胞和机体损伤的保护作用显示出十分明显的特点和效应。
本次实验研究结果显示出，MCC950对于视网膜血管内皮细胞损伤具有很大的作用，通过添加MCC950分别在3倍和10倍浓度的药物后，其降低内皮细胞的ROS和MDA浓度，且提高细胞的活性。这些作用全部表明，MCC950对于视网膜免疫抵抗和细胞凋亡具有显著的保护作用。
结论
本次研究中，我们首次证明了MCC950可以通过降低RECs内的ROS水平减轻高糖诱导的细胞毒性（包括凋亡）和损伤作用，保护内皮细胞对于高糖的恶劣环境介导的伤害和细胞死亡。这表明MCC950具有作为糖尿病视网膜病变的治疗新药的潜力。