血管内皮祖细胞(EPC)与自体骨髓干细胞移植.ppt

血管内皮祖细胞（EPC）与自体骨髓干细胞移植1997年Asahara等首先描述了循环于外周血中的内皮祖细胞（endothelialprogenitorcell，EPC）。

应用免疫磁珠法首先从外周血分离CD34+细胞，经在纤维连接蛋白（fibronectin,Fn）预衬的培养皿培养，这些细胞转变成内皮特征细胞。

意义：
（1）更正并充实了长期以来人们所认识的血管新生机制
（2）为缺血性疾病及恶性肿瘤的治疗提供了新的靶点血管内皮祖细胞（EPC）血管内皮祖细胞（EPC）图1EPC的来源，AB代表angioblasts血管内皮祖细胞（EPC）血管内皮祖细胞（EPC）血管内皮祖细胞（EPC）血管内皮祖细胞（EPC）血管内皮祖细胞（EPC）EGM-2MV培养液(包含5%FBS、VEGF、hFGF-b、hEGF、IGF-1、Hydrocortisone和Ascorbicacid等)(Cambrex)，IMDM培养液(Hyclone)，DMEM完全培养液(中日友好临床医学研究所)，FBS(Hyclone)
Fibronectin(Sigma)，Histopaque-1077(Sigma)，MTT(Sigma)，Dil-ac-LDL(BTI)
抗Ⅷ因子单抗(Zymed)，抗flk-1单抗(SantaCruz)，抗CD133单抗(MiltenyiBiotec)
APC标记的CD34单抗(BD)，FITC标记的CD133单抗(R&D)，PE标记VEGFR-2单抗(R&D)
酶标仪(Pasteur)，流式细胞仪(BectonDickinson)，Olympus倒置相差显微镜，Olympus普通光学显微镜，Nikon荧光显微镜，JEM-1010型透射电子显微镜(JEOL)
技术路线培养48小时，可见长梭形、三角形、纺锤形或不规则形贴壁细胞呈集落样生长
第9～11日，原代细胞汇合成层，近似单层铺路石状排列
原代汇合时，平均每毫升骨髓可获细胞约(1.3±0.3)×106

细胞生长曲线

第5代，细胞增殖明显减缓
TEM检测功能检测：
增殖效率：
新分离的BMMNCs，CD34、VEGFR-2和CD133三个表面抗原均阳性的细胞占0.12%
第10天，VEGFR-2和CD133双阳性细胞达29.03%，增加了242倍目前，获取EPCs的方法主要有两种
表面抗原分离法,具体采用免疫磁珠法获得
离体扩增培养法
表面抗原分离法不可能获得纯度较高的EPCs
上述三种细胞表面抗原也同时存在于造血干细胞
尚存在CD34¯内皮祖细胞
免疫磁珠法具有操作复杂、反复筛洗使获取细胞活性降低、费用高等缺点，不适于临床应用和大规模培养
离体扩增培养法不仅可以克服上述缺陷，还因为BMMNCs中含有CD34+和CD34-细胞，共培养这些细胞还可促进CD34+的EPCs增殖新分离的BMMNCs中的含有也同时表达上述三个表面抗原的HSCs，而扩增10日的贴壁细胞中不会含有HSCs，故实际扩增倍数要高得多
免疫细胞化学和流式细胞术
Ⅷ因子亦呈明显阳性反应，说明EPCs在向成熟方向—ECs转化
阳性细胞率不完全一致
两种方法的敏感性不一致
目前没有商品化的犬的单克隆抗体可利用
胰蛋白酶消化贴壁细胞时也破坏了一定数量的细胞表面抗原结论（1）胚胎干细胞向内皮细胞分化试剂配制ESC的形态学观察ESC的鉴定ESC的鉴定ESC的鉴定拟胚体形成拟胚体形成：悬浮培养法ESC的分化诱导——简单两步法拟胚体的分化种植分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定分化细胞的鉴定结论（2）EPC的临床应用与骨髓干细胞移植EPC参与出生后诸多的生理过程
补充血管壁脱落的EC
女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与
转基因小鼠的系统研究证明，在脑、肺、肝、肠、皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞，在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显EPC参与了出生后诸多的病理过程
肢体缺血
心肌梗塞
肥胖相关疾病：Ⅱ型糖尿病、高血压、高血脂
糖尿病视网膜病变
肿瘤
动脉粥样硬化治疗性血管发生（therapeuticvasculogenesis）
1999年，Isner等首先提出了“治疗性血管发生”的概念
倡导以提高补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病
这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在EPC、EPC对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力、EPC能分化形成血管的生物学特性，可以说是一个生理加强疗法。
治疗性血管发生EPC功能分类治疗肢体缺血治疗急性心肌梗塞治疗急性心肌梗塞
肿瘤细胞可分泌多种与血管生成有关的细胞因子如bFGF、aFGF、VEGF、HGF和angiopoietin等，这些细胞因子动员骨髓EPC进入