细菌内毒素检查法讲义.ppt

细菌内毒素检查法背景介绍：一、细菌内毒素特性：二、热原热原和内毒素的关系：三、鲎鲎试剂2010年版药典细菌内毒素检查法介绍综述部分细菌内毒素检查法的定义：细菌内毒素检查法介绍试验的准备细菌内毒素标准物质细菌内毒素检查用水漩涡混合器漩涡混合器干热恒温器恒温水浴试验器械
移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10×75mm）、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。

试验的准备试验的准备限值（L）的确定限值计算时做必要调整的几种情况
从严原则
联合用药
特殊情况等确定最大有效稀释倍数（MVD）计算举例
a当L以EU/ml表示时，则浓度C的单位为1.0ml/ml
适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应
小于xxEU/ml。

例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用
灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则：
MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.125EU/ml＝4倍计算举例
b当L以EU/mg表示时，则C的单位为mg/ml或U/ml适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xxEU/mg或EU/U。

例：注射用阿莫西林钠
计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验。
需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。
如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。
MVD＝20mg/ml×0.15EU/mg÷0.25EU/ml＝12倍如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD
取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；
适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。

例：注射用阿莫西林钠
计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。
最小有效稀释浓度
c＝0.125EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml实验部分目的
－考察鲎试剂的灵敏度是否准确
－考察检验人员操作方法是否正确
－实验条件是否符合规定

何时进行
－使用新批号的鲎试剂
－试验条件发生可能影响检验结果的改变时
实验操作:鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度复核试验坚实凝胶

阳性“+”
未形成凝胶凝胶不坚实

阴性“—”结果判断：若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管阴性，试验方有效。
结果计算：反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值
λc=lg-1(ΣX/4)
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。
（反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。）鲎试剂灵敏度复核试验当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查。
实验时，以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

凝胶法干扰试验凝胶法干扰试验凝胶法干扰试验目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据；
优点：减少摸索过程、节省成本。
操作步骤：
将供试品溶液进行一系列倍数的稀释；
使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一稀释倍数下做2支供试品管和4支供试品阳性对照（即含2.0λ和0.25λ浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）；
另做2支阴性对照和2支阳性对照。预试验结果判断：
当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效；
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，供试品阳性对照0.25λ管均为阴性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数和相邻浓度进行正式干扰实验。正式干扰试验正式干扰试验
操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液编号结果判断内毒素浓度当存在干扰时，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或有关其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。凝胶法干扰试验检查法－凝胶法凝胶限度试验例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验，计算：
MVD＝1.0ml/ml×0.5EU/ml÷0.25EU/ml＝2倍
供试品溶液：2倍替硝唑稀释液
供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的2倍替硝唑稀释液
阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液凝胶限度试验结果判断凝胶限量试验结果判断凝胶限量试验结果判断凝胶半定量试验凝胶半定量试验凝胶半定量试验溶液的制备凝胶半定量试验－结果判断凝胶半定量试验－结果计算