植物组织培养-外植体的选择与建立.ppt

第三节外植体（培养物）的建立第二节外植体（培养物）的选择1、基因型：
再生能力
（1）、双子叶>单子叶；
（2）、被子植物>裸子植物；
（3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）；苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae）再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。
（4）、同一种植物中：活体（invivo）再生力强者，离体（invitro）再生力也强。杜鹃花‘Rhodoendron’2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：杜鹃花‘vanWeerdenPoelman’第二节外植体（培养物）的选择3、根据时间和季节取材3、根据时间和季节取材4、根据母株位置选择：第二节外植体（培养物）的选择第二节外植体（培养物）的选择第二节外植体（培养物）的选择第二节外植体（培养物）的选择第二节外植体（培养物）的选择第二节外植体（培养物）的选择4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。
植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面的研究进展较快。（1）、产生污染的因素：
①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多；带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。
②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况，以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。
③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。
④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。培养室相对湿度太高时，污染加重。（2）、污染的防止：
母株保护：保持母株清洁，减少喷灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂，减少病原菌含量。
材料选择：选取生长发育健壮，病虫危害少的材料。
严格清洗、消毒与无菌操作。
小容器、分散接种。（3）、污染估算及对策：
污染估算：首次接种通常污染率40—60%
按40%计：接种100个材料
1个材料/容器：
污染量=100X40%=40
获得量=100-40=60。
2个材料/容器：
2污染：1X40%X40%=16%
1污染：2X40%X40%=32%
2未污染：60%X60%=36%
污染率=100-36=62%
污染量=100X62%=62
获得量=100-62=48（4）、附生菌控制：
采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。
取材来源：
从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。
所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
材料预处理：
在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5％Tween20浸1h（其间换新鲜液2～3次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10％的杀藻铵（BenzalkoniumChloride）溶液浸渍材料10min，效果很好。（5）、内源菌防治：
植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌，而对材料组织内部所带的细菌往往难以对付。
表面污染与内源污染的区别：常见内源菌：芽孢杆菌（rodbacteria）为主，尤其是Bacilusli