高效液相色谱法h【共55张PPT】.ppt

高效液相色谱法h1．高效液相色谱法与经典液相色谱法2．高效液相色谱法与气相色谱法(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。

高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。高效液相色谱法分类
1.吸附色谱
用固体吸附剂为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样各组分在吸附剂上吸附性能差异实现分离。
2.分配色谱
用涂渍或化学键合在载体基质上的固定液为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样各组分在固定相中溶解、吸收或吸着能力差异实现组分分离。
3.离子交换色谱
用含离子交换基团的固定相，以一定pH含离子的溶液为流动相，基于离子型组分与固定相离子交换能力差异实现组分分离。
4.体积排阻色谱
用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按组分分子体积差异，即分子在固定相孔穴中体积排阻作用差异实现组分分离。根据固定相和流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系。
反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性。
反相色谱中固定相是非极性的，通常是烃类，流动相是相对极性的水、甲醇、乙腈。
正相色谱中固定相是极性的，流动相是相对非极性的正己烷、异丙醚。
正相色谱中极性最小的组分最先析出，反相色谱中极性最大的组分最先析出。第二节高效液相色谱仪2、进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。
进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；
由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。
对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。
如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；
也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的LichrosorbALOXT。
标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000。
当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。
由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。
在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；
对于细粒度的填料（＜20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。
反相色谱中固定相是非极性的，通常是烃类，流动相是相对极性的水、甲醇、乙腈。
不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。
关于pH值的影响，要视不同情况而定。3、分离系统-色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。
一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上
一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。4、检测系统
在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。
另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。第三节固定相和流动相一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。
与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。
此法的固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等；
（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。
选择溶剂还必须与检定器相匹配。
第三节固定相和流动相
对流动相溶剂的要求是：
反相色谱中固定相是非极性的，通常是