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可长期稳定维持印记的孤雄单倍体胚胎干细胞的建立及机制研究的开题报告
一、研究背景及意义
在生物医学领域，干细胞在组织再生、疾病治疗和药物筛选等方面具有广泛应用前景。然而，传统的干细胞研究都依赖于从多细胞体中分离和培养干细胞。缺点是干细胞的长期维持存在困难，且易发生异质性、度过期性等问题，因此，采用不需维持多细胞体而直接制备的单倍体胚胎干细胞（haploidembryonicstemcells，hESCs）成为新的研究热点。该类细胞具有多种生物学特征，如自我更新、高度可塑、免疫原性低、遗传稳定等。因此，建立可长期稳定维持印记的haploidESCs系列cellline并深入研究其机制，将对干细胞基础理论及其应用开拓具有深远的意义。
二、研究目的
本研究旨在建立一套完善的haploidESCsculturingprotocols，并使用获得的haploidESCsseriescellline，系统研究：其稳定性的机制、细胞生长、自我复制和分化能力的关系、细胞信号通路等方面内容，解析haploidESCs基础细胞生物学、形成和维持基因表达印记、特殊细胞特性等方面的机理。
三、研究内容
（一）haploidESCs维持印记的机理研究
1.建立Stella、Pou5f1、Dppa3等细胞标志基因在haploidESCs中的表达模式；
2.探讨DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学改变在haploidESCs中维持基因表达方式的作用；
3.研究相关转录因子和表观遗传修饰因子参与维持基因表达印记的相互作用机制及其对全基因组表达调节的影响。
（二）haploidESCs的自我更新和分化机理研究
1.通过建立稳定性的mapk/erk、pi3k/akt、wnt等激活或抑制细胞信号通路的细胞系，了解这些分子通路对自我更新和分化的调节作用，建立良好的细胞信号调节策略；
2.建立全转录组和组蛋白连锁法分析haploidESCs维持自我更新的基因网络及其调节机制，分析与全基因组调控之间的相互作用；
3.建立自我分化的细胞系，通过单细胞转录组和系统发育的分析来解析如何确保haploidESCs自我更新与分化之间的平衡点，挖掘关键基因。
（三）haploidESCs的稳定性机理与控制维度的研究
1.探究不同生长阶段haploidESCs在细胞周期、DNA损伤诱导和凋亡等方面的模式和机理，建立haploidESCs典型的细胞生命周期；
2.通过建立该cellline，以及构建稳定性生长诱导和基因敲除的模式，研究不同基因与细胞生长和存活的关系，筛选影响haploidESCs生长和稳定性的关键候选因子。
四、研究方法和技术路线
本研究计划使用一系列的细胞生物学和分子生物学方法，以建立haploidESCs作为模型细胞系，探索haploidESCs的生长和分化机理。具体流程和方法如下：
（一）haploidESCs的琼脂糖培养
通过华盛顿大学刘昊教授的提供，获得HaploidESCs（hpESCs）系列细胞。细胞培养液包含基础DMEM/F12（Gibco）,15%胎牛血清（FBS，Gibco），100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素，2mML-glutamine，0.1mM非必需氨基酸，0.55mM2-mercaptoethanol（插图1A），玻璃显微镜下haploidESCs形态如插图1B。稳定生长的单染色体细胞系先在2.5cm胶原贴片中形成一个典型的边缘生长截面，随后带入立体扩大模式；用于常规和分子生物学研究。
（二）基因表达和蛋白质定位分析
执行定量PCR，细胞因子arraray，RNA-Seq和ChIP-Seq分析，探究haploidESCs各层面上的基因表达模式和蛋白质组分析。可以通过纯化蛋白质和酶切事先标记染色体留存知识特异性抗体，配合初步的电镜和facs检测haploidESCs的表观修饰和蛋白质变化。
（三）haploidESCs激活和抑制细胞信号通路研究
使用几种宿主细胞维持haploidESCs，通过特定信号诱导剂类比MAPK、PI3K、WNV等信号通路的活性，建立模式，筛选影响自我更新和分化的因素，并通过药物和基因敲除干预分析haploidESCs基因调控意义，探究haploidESCs生长和自我维持的机理。
（四）质谱学和氧化还原代谢分析
haploidESCs很可能对氧化还原代谢产生相当重要的调节作用，采用FACS或流式细胞术等方法分离haploidESCs，进行减少分析和针对重要酶的纯化处理。
五、研究进展和预期结果
本研究计划建立长期维持稳定的haploidESCscellline，探究haploidESCs相对于其他干细胞类型和正常多细胞体细胞的独特特性、生物学特征和基础机理，首次建立产生研究益处的haploidESCs的策略。