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应用CRISPRCas9技术构建Tph2基因敲除猪模型的开题报告
开题报告：
题目：应用CRISPRCas9技术构建Tph2基因敲除猪模型
一、选题的背景及研究意义
Tph2基因是编码芳香氨基酸羟化酶2的基因，是5-羟色胺合成的关键酶之一。研究表明，Tph2的缺失可以导致5-羟色胺水平下降，引起多种精神疾病，如焦虑、抑郁、精神分裂症等。目前已有研究证实，Tph2基因敲除小鼠具有5-羟色胺减少和行为异常的现象。但小鼠模型由于其小体型、繁殖周期长、并不能完全代表人类相关疾病，因此需要寻找更适合的疾病模型。
豚鼠、猕猴、猪等动物的身体大小、生理生化特征、脑结构相对人类更为接近，具备潜在成为人类疾病模型的可能性。猪是人类药物试验和组织移植研究的常见疾病模型之一，其进食、运动、睡眠等生理活动与人类较为相似，因此开发猪疾病模型是当前研究的热点之一。
目前，CRISPRCas9基因编辑技术成为疾病模型构建的主要手段之一，其在权威期刊《Science》、《Nature》等上曾多次发表高水平文章。本研究将运用CRISPRCas9技术在猪基因组上构建一个Tph2基因敲除的疾病模型，为人类相关疾病研究提供新的研究平台。
二、研究目标
1.建立Tph2基因敲除猪模型，确认敲除效果；
2.观察Tph2基因敲除对猪行为、生理及代谢的影响；
3.为人类相关疾病研究提供基础资料。
三、研究方法
1.CRISPRCas9质粒的构建与筛选
设计sgRNA靶向Tph2基因的序列，并将其克隆入Cas9质粒，用sgRNA验证Cas9的敲除效果。
2.猪胚胎细胞培养和基因敲除
收集猪卵巢组织，分离卵母细胞和卵外囊膜细胞。将卵母细胞取出进行体外成熟和受精，获得受精卵并进行培养。在受精卵中使用合适剂量的sgRNA和Cas9蛋白，通过电孔转化方式送入卵核进行基因敲除，筛选敲除效果较好的胚胎进行移植。
3.筛选合适胚胎进行移植
从基因敲除胚胎中筛选出具有较好发育潜力的胚胎，进行移植到代孕母猪体内，完成妊娠进行繁殖。
4.猪内源性Tph2基因的检测
通过PCR、Westernblot、RT-qPCR等技术方法检测Tph2基因敲除猪的基因组水平、蛋白质水平和转录水平，确定敲除效果。
5.行为、生理及代谢表型的评估
对Tph2基因敲除猪的行为、生理、代谢表型进行评估，包括活动时间、食欲、体重、皮下脂肪含量、血糖和血脂含量等多个方面的指标。
四、研究计划
本研究计划历时18个月，按照以下时间表进行：
1.第1-2月：文献调研，设计实验方案；
2.第3-6月：CRISPRCas9质粒的构建和筛选，sgRNA验证Cas9的敲除效果；
3.第7-10月：猪胚胎细胞培养和基因敲除，筛选出具备植入能力的胚胎；
4.第11-14月：筛选合适胚胎进行植入，完成繁殖；
5.第15-18月：猪内源性Tph2基因检测、行为、生理及代谢表型评估和数据分析。
五、研究预期成果
1.建立Tph2基因敲除猪模型；
2.明确Tph2基因敲除对猪行为、生理及代谢的影响；
3.提供CRISPRCas9基因编辑技术在疾病模型构建上的新思路和平台；
4.为人类相关疾病研究提供研究依据和实验平台。
六、论文写作计划
研究完成后，根据评估结果撰写一篇12000字左右的学术论文，包括以下部分：绪论、材料和方法、结果、讨论和结论，配合相关的实验数据、图片，并提交相关学术刊物评审。同时，还计划撰写一篇1000-1500字的学术PopularScience文章，向社会大众普及疾病模型构建的相关知识，提高公众科学素养。