大豆蛋白的提取与含量测定.ppt

大豆蛋白的提取与含量测定蛋白质化学实验蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定条件下（如PH，离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分子的大小及形状等方面的差异，可以采用电泳，离子交换柱层析等方法对它们进行分离分析。
许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度，产生可逆或不可逆沉淀，这些因素（如增加溶液的离子强度，降低溶液的介电常数，调节溶液的PH等）以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来分离，提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌握好理论和实践相结合，把学到的理论应用到实验中，本系列实验安排是从一种生物中提取蛋白质，通过各种物理化学性质使其得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。

蛋白质性质与应用技术关系图一、大豆蛋白的提取试剂和器材操作方法

蛋白质产物重量
蛋白质产率=×100%
原料总重量
思考题
1、用丙酮沉淀蛋白时，为何要调PH4.5~5.0？
2、大豆中哪类蛋白含量最多？
Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分Folin酚法测定蛋白质含量由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。
样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。
Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。
试剂和器材4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。
上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：操作方法Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定2、样品测定：取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲线（可取两支试管编号8、9，与工作曲线同时进行反应和比色测定）；
3.蛋白质浓度的计算：
A650值对应的mg数(Pr)
Pr(mg/ml)=×稀释倍数
Pr溶液的ml数