预览加载中，请您耐心等待几秒...

SYBRGreenI荧光定量PCR教案.pptx

预览
1/10
2/10
3/10
4/10
5/10
6/10
7/10
8/10
9/10
10/10

亲，该文档总共65页，到这已经超出免费预览范围，如果喜欢就直接下载吧～

下载提示 文本预览

如果您无法下载资料，请参考说明：

1、部分资料下载需要金币，请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档，再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压，在使用对应软件打开

会计学主要内容PCR技术的发明PCRPolymeraseChainReaction2.PCR原理PCR类型实时荧光定量PCR技术real-timefluorescentquantitativePCRFQ-PCR实时荧光定量PCR技术分类提RNA基本步骤RNA的抽提注意事项一、标本的处理 新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。 二、匀浆：Trizol 裂解细胞，使核蛋白体解离，释放RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入水相。 过多：上清液变为红色，浪费。 过少：未加氯仿前即分层。 裂解不充分，RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。 三、抽提、分层：氯仿 变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。 过少：上述作用减弱，影响RNA质量。 过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。 四、沉淀：异丙醇 过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。 五、洗涤：75%乙醇 去盐作用，根据情况可重复几次。 六、溶解：DEPC水 掌握溶解时间。 太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。 太迟：沉淀物太干，不易溶解。 RNA得率检测——分光光度计 260nm:核酸 280nm:蛋白等有机体 230nm:杂质浓度 320nm:溶液浑浊度 总RNA浓度（ng/µl）=OD260×40×稀释倍数（ng/µl） OD260读数介于0.1～1.0之间可靠 （20～3200ng/µl）RNA的质量RNA完整性鉴定RT反应体系RT引物的选择RT反应条件RT反应的注意事项SY法-PCR反应基本组分PCR实验操作注意事项PCR反应条件结果：扩增曲线熔解曲线理论扩增曲线数据分析：总结第七部分：常见问题分析问题1：无Ct值出现问题2：Ct值出现过晚问题3：阴性对照有信号问题4：溶解曲线不止一个主峰问题5：重复性差问题6：熔解曲线只有上升支问题7：扩增曲线异常问题8：扩增熔解曲线不同，ct值却相同问题9：ct值不同，熔解曲线同，扩增曲线还高问题10：预实验时为单峰，正式时为杂峰。问题11：模板降低时，扩增效率低。问题12：未调基线和阈值Sybrgreen过多抑制反应？？