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循环肿瘤DNA检测在乳腺癌诊断中的临床应用.pdf

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循环肿瘤DNA检测在乳腺癌诊断中的临床应用 叶青，江泽飞 军事医学科学院附属医院乳腺肿瘤科 随着二代测序技术的发展，循环肿瘤DNA（ctDNA）检测在乳腺 癌中的应用得到越来越多的关注。目前国内外大量研究显示ctDNA检 测技术在监测肿瘤负荷、疗效预测、早期诊断、预后分析等方面具有 广阔的应用价值。在乳腺癌诊疗走向个体化精准的时代，ctDNA检测 能够为患者提供更为精准的诊断，指导临床治疗。 早在1948年，Mandel和Metais就在人的血浆中检测出细胞外 游离DNA的存在，由此拉开了游离DNA研究的序幕；1965年， Bendich的团队发现肿瘤与循环游离DNA（cfDNA）存在相关性； 1977年，Leon等人通过放射免疫测定法对比了正常人和肿瘤患者血 中游离DNA的表达，表明血中游离DNA水平与肿瘤病程及疗效相关； 随后更多证据表明血中游离DNA与原发肿瘤基因突变存在一致性 【1】；2010年，García-Olmo等【2】的研究确定了游离DNA的致 癌性。近几年循环DNA的研究已成为癌症诊断的热门研究领域，在肿 瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移监测、早期诊断及预后分析等 方面具有潜在的临床应用价值。 1循环肿瘤DNA（ctDNA） 1.1cfDNA与ctDNA cfDNA是由正常细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞等凋亡、坏死后 释放到血管中的游离的DNA片段组成的。这些DNA片段通常与蛋白 质结合形成核小体游离于循环中【3】。其中ctDNA特指能够反映肿 瘤基因组信息的cfDNA【4】。 关于ctDNA的释放、降解机制目前尚无定论。目前认为，ctDNA 来源于坏死、凋亡的肿瘤细胞，或是肿瘤细胞的外排体【5】。而 ctDNA的降解可能与肝脏和肾脏代谢相关，根据不同DNA片段大小、 结构其半衰期差异较大，范围从10min至2h不等。 1.2ctDNA的检测优势及困难 组织学活检能够提供疾病的初始状态，为疾病的诊断、治疗提供 重要的信息。尽管组织学检测目前是临床和科研测序的金标准，但是 组织获取、样本保存、肿瘤异质性等局限性限制了肿瘤组织测序的发 展。因此，为了弥补组织活检的局限性，研究者开展“液体活检”工 作。因能反映与组织相同的基因组信息，ctDNA成为补充替代组织学 测序的最佳来源。相对无创的ctDNA检测不仅能够反映短时间体内瘤 负，实时动态监测药物疗效，而且在保证较高敏感性和特异性的同时 能够提早预测病情变化。 在原理上，ctDNA测序简单易懂，但该技术用于临床仍面临着许 多技术难点和现实问题。首先是对于大部分肿瘤患者而言，在全部的 血浆游离DNA中，ctDNA只占很小的一部分，大约只有千分之几 【6】，因此，目标突变信号相对与背景信号其强度极低。其次，因每 毫升血浆中仅有几十至几百纳克（ng）的游离DNA，分离样本量极少 的cfDNA难度大。传统的酚-氯仿抽提法提取效率低，而商业试剂盒 简便易行，且可以针对不同目标检测设计专门的试剂盒。Kuang等 【7】对比了以下3种商业试剂盒分离cfDNA的效能：QIAampDNA Micro试剂盒（德国Qiagen公司）、NucleoSpinPlasmaXS（德国 Macherey-Nagel公司）和Wizaed（美国Promega公司），结果显 示QIAampDNAMicro试剂盒更适用于ctDNA的检测。此外，由于 ctDNA检测技术对实验室和操作人员要求较高，检测设备昂贵，检测 标准不一，也难以在短时间内推广至临床应用。 1.3ctDNA检测方法 理论上，所有检测基因组信息的手段都可以检测ctDNA，但是由 于以sanger测序为代表的一代测序方法检测敏感性不高，长久以来一 直限制着ctDNA检测的发展。随着二代测序技术的出现，使cfDNA 的检测成为可能。目前，常用的方法包括实时荧光定量聚合酶链反应 （RTFQ-PCR）、磁珠乳液扩增（BEAMing）技术【6】、基因芯片 技术和二代测序技术等，这些检测各有其优缺点（表1）。 2ctDNA检测在乳腺癌中的临床应用 关于乳腺癌ctDNA的研究，可以追溯到1977年，Leon等人发 现乳腺癌患者的血液中游离DNA水平显著上升，通过放射免疫检测法 他们检测到这些游离DNA范围在0～2000ng/mL间波动【1】。此 后，大量乳腺癌的ctDNA临床应用的文献被报道，这些应用主要集中 在ctDNA与肿瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移风险评估、早期 诊断及预后分析等方面。 2.1ctDNA与肿瘤负荷监测 肿瘤负荷监测是指对肿瘤危害机体程度的监测，包括肿瘤大小、 活跃程度、转移情况等，是乳腺癌患者管理的重要内容之一。临床实 践中，一般通过影像、蛋白质类生物标志物（CEA、CA15-3和CA- 125）来监测肿瘤负荷