东亚飞蝗谷胱甘肽s-转移酶基因克隆、基因表达及蛋白纯化的任务书.docx

东亚飞蝗谷胱甘肽s-转移酶基因克隆、基因表达及蛋白纯化的任务书
任务书
题目：东亚飞蝗谷胱甘肽s-转移酶基因克隆、基因表达及蛋白纯化
一、任务背景：
东亚飞蝗是一种重要的农业害虫，其飞蝗群落后果严重，乃至于揭示出这种害虫基因调控与代谢物积累的作用机制成为研究的重要方向。谷胱甘肽s-转移酶(GST)是一种广泛存在于生物体内的酶类物质，也是一种重要的代谢物合成酶。据此，我们尝试在东亚飞蝗中寻找GST基因，并对其进行克隆、基因表达及蛋白纯化和分析，以期了解东亚飞蝗代谢物的代谢机理。
二、任务内容：
1.通过生物信息学方法在东亚飞蝗基因组数据中寻找并筛选出GST基因。
2.根据获取的GST基因序列设计克隆引物，并利用PCR技术在东亚飞蝗中进行GST基因的扩增和克隆。
3.对克隆得到的GST基因进行测序，验证此基因是否与GST基因高度同源，并对其进行多序列比对和进化树构建分析。
4.以GST基因克隆片段作为模板进行杂交PCR，获得GST基因的完整片段，同时采用重组表达载体pColdII进行GST基因的表达。
5.进行GST蛋白的纯化和鉴定，利用SDS-PAGE和Westernblotting等技术手段对蛋白纯化后的GST酶进行鉴定，并检测其酶活性。
6.通过分析GST基因重要的启动子区域和基因座位，了解东亚飞蝗GST基因在调控代谢产物过程中的作用机制，以及可能存在的调节因子。
三、实验材料和设备：
实验材料：东亚飞蝗组织样本、DNA纯化试剂盒、PrimeSTAR®HSDNA聚合酶、端粘性酶、琼脂糖、PCRCleanUpKit、Ni-NTAResin等。
设备：PCR仪、快速冷冻离心机、高速离心机、植物基因转染仪、蛋白印迹仪、UV可见分光光度计等。
四、实验步骤：
1.样品制备及基因克隆
制备东亚飞蝗样品，并从中提取全基因组DNA；根据生物信息学分析结果设计引物，进行PCR扩增和基因克隆。
2.基因测序
利用高通量测序技术对GST基因进行完整测序，获得GST基因完整序列。
3.多序列比对和进化树构建分析
使用多种工具进行多序列比对，建立相应的进化树模型，对GST基因进行进化分析。
4.模板扩增和表达受体构建
采用杂交PCR技术扩增GST基因的完整模板，并将此模板构建入重组表达载体pColdII。
5.GST蛋白的表达和纯化
将质粒转化入表达菌中，经过诱导表达并获得纯化蛋白。
6.GST酶鉴定及酶活性测定
利用Westernblotting和SDS-PAGE等技术手段对GST酶进行鉴定，最终测定其酶活性。
7.GST调控机制分析
利用生物信息学等手段对GST基因和启动子进行分析，了解其调控机制和代谢产物调节模式。
五、任务要求：
1.具备经验丰富的实验技能、独立撰写论文的能力；
2.精通生物信息学，能熟练使用相关软件工具进行数据分析和处理；
3.细心严谨，有较强的实验质量控制能力；
4.具备良好的沟通能力和团队协作精神。
六、预期成果：
1.完整的东亚飞蝗GST基因序列以及多序列比对和进化树构建分析结果；
2.成功构建入表达载体并表达获得GST蛋白，完成蛋白纯化及GST酶活性测定，并获得酶活性图谱；
3.GST调控机制分析结果，可为东亚飞蝗代谢产物代谢机制研究提供新思路和突破；
4.进行实验记录并撰写实验报告（8000字以上），并参加学术报告评议和现场答辩。
七、进度安排：
第一周：收集相关文献，准备生物信息学数据分析工具和文件，开始DNA提取和基因克隆；
第二周：利用高通量测序技术对GST基因进行完整测序；
第三周：进行多序列比对和进化树构建分析；
第四周：完成模板扩增和表达受体构建，进行质粒转化入表达菌中；
第五周：诱导表达并获得纯化蛋白；
第六周：对GST酶进行鉴定，测定其酶活性，并绘制酶活性图谱；
第七周：分析GST基因和启动子区域，了解东亚飞蝗GST基因的调控机制；
第八周：进行实验记录并撰写实验报告；
第九周：参加学术报告评议和现场答辩。