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农杆菌介导的菘蓝遗传转化的任务书
任务书
一、任务目的
本次实验的主要目的是通过农杆菌介导的菘蓝遗传转化，将外源基因导入到菘蓝中，使其获得新的特性，丰富菘蓝在农业生产和科学研究中的应用。
二、实验原理
1.农杆菌介导的遗传转化
农杆菌介导的遗传转化即利用农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）将外源基因转移导入到植物细胞中的一种遗传转化方式。农杆菌带有土壤杆菌质粒Ti，其含有T-DNA区域，是将基因转化导入植物细胞中的关键因素。体外培养准备细胞、制备农杆菌、共培养、筛选转化株等步骤是农杆菌介导的遗传转化方法。
2.菘蓝
菘蓝（Perillafrutescens），属唇形科茜草属多年生常绿草本植物，是肉桂醛的主要来源。菘蓝具有广泛的药用价值，可用于治疗咳嗽、哮喘、鼻炎等疾病。此外，菘蓝还具有良好的抗氧化性能。
3.目标基因
本次实验选取的目标基因是菌翅素基因（Btgene）。这一基因可以在猪苗虫中表达，将其导入菘蓝中可以使菘蓝具有抗虫特性，提高其在农业生产中的应用价值。
三、实验步骤
1.菘蓝预处理
将菘蓝种子用75%的乙醇消毒，除去外部污染，再用蒸馏水清洗种子表面，防止杀菌剂残留。然后将种子在无菌条件下接种到含有适量激素的MS培养基中，进行离体培养，直至生长出白色的愈伤组织。
2.制备农杆菌
制备农杆菌需要分别准备培养基和细胞悬液。培养基包括LB和YEB培养基，在无菌条件下准备后加入一定量的抗生素（如卡那霉素、青霉素等），则可制得适宜培养农杆菌的培养基。细胞悬液则是将培养好的农杆菌分别转接到液体培养基中，培养到到达指定的OD600值时，收集农杆菌并用含有150mM乙酸和10mMMgCl2的2倍YEP培养基洗涤并浓缩，最终获取需要的农杆菌。
3.构建转载体
将Bt基因首先克隆到在PUC18载体中，然后将Bt基因放在植物响应基因体系的控制下，利用pBI121基因载体构建我们这次实验中需要的转载体。
4.转染
将菘蓝愈伤组织与农杆菌接种，在共培养过程中，利用洋菜胶过滤处理菘蓝愈伤组织。共培养周期一般为12-16小时，接种菌量一般为OD600为0.7-1.0。完成共培养后，用含有抗生素的MS培养基对愈伤组织进行筛选。
5.筛选
在接种过程中，菘蓝愈伤组织和农杆菌相互作用进行共培养，因此只有愈伤组织上的细胞被成功转化后，才能生长成植株。一般需要选用含有抗生素的培养基进行筛选。筛选成功的植株，可以在无菌条件下继续培养，并逐步壮大。
6.检测
将实验结果进行分析统计，验证是否达到预期效果。检测可以包括PCR检测、Westernblotting和生化分析等。
四、参考文献
1.张婷;《种子离体培养及转化马鲡草Bt基因》;《中国生物制品学杂志》
2.许辉等;《植物遗传转化技术及其进展》;《生物技术进展》
3.缑鑫等;《近12年我国植物遗传转化的文献计量学分析》;《植物学报》