FBP17基因真核重组质粒构建及其L02细胞表达的任务书.docx

FBP17基因真核重组质粒构建及其L02细胞表达的任务书
任务书
一、任务目的
本实验的目的是构建FBP17基因真核重组质粒并在L02细胞中进行表达，旨在探究FBP17基因在肝细胞中的功能以及其与疾病发生发展的关系，为进一步研究FBP17基因在组织器官形成、细胞迁移、转化、肝癌等方面的作用提供实验基础。
二、任务内容
1.质粒构建
（1）利用引物扩增出目的基因FBP17的全长序列，将其连接至真核重组质粒pEGFP-C1上，构建重组质粒。
（2）测序鉴定构建质粒的正确性和准确性。
2.细胞培养
选择L02细胞作为研究对象，进行细胞培养和维护。
3.质粒转染与表达检测
（1）采用Lipofectamine3000转染剂将构建好的重组质粒转染至L02细胞中。
（2）利用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察L02细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。
（3）利用Westernblot方法检测FBP17蛋白在L02细胞中的表达情况。
三、实验步骤
1.FBP17基因扩增
根据已知的FBP17基因序列设计引物并利用PCR扩增出FBP17基因，PCR反应体系为20μL，其中包括10μL2×TaqMasterMix、1μL模板DNA、1μL引物(10μM)、8μLddH2O，PCR反应程序为：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃60s，共32个循环，最终72℃保持10min。
2.构建质粒
将扩增出的FBP17基因ligation至pEGFP-C1载体DNA中，转化进入大肠杆菌DH5-α中，筛选出重组质粒。
3.质粒测序鉴定
将成功构建的重组质粒进行测序鉴定，确保质粒的正确性和准确性。
4.细胞培养
选择L02细胞作为实验对象进行细胞培养和维护，利用DMEM培养基，含10%胎牛血清，37℃恒温、5%CO2培养。
5.质粒转染
采用Lipofectamine3000转染剂将构建好的重组质粒转染到L02细胞中，处理完毕后，在适当时间内观察转染效果。
6.荧光显微镜观察
在转染48h后，采用荧光显微镜观察L02细胞内绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，获得GFP荧光图像。
7.激光共聚焦显微镜观察
在转染48h后，采用激光共聚焦显微镜观察L02细胞内GFP的表达情况，观察其分布位置及明亮度。
8.Westernblot检测
在转染48h后，利用Westernblot方法检测FBP17蛋白在L02细胞中的表达情况。
四、安全注意事项
1.操作时应戴实验手套，避免口鼻、眼及伤口直接接触实验物质。
2.扉门、通风口等保持良好的通风状态，避免有毒气体积蓄。
3.操作台面要维持清洁状态，避免实验物质污染环境及交叉污染。
4.实验完成后，实验物质要按规定处理。
五、实验预期结果
1.成功构建FBP17基因真核重组质粒。
2.成功转染FBP17基因真核重组质粒至L02细胞中。
3.观察荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下L02细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。
4.成功利用Westernblot方法检测FBP17蛋白在L02细胞中的表达情况。
5.为研究FBP17基因在肝细胞中的作用及其与疾病发生发展的关系提供实验基础。
六、参考文献
1.Cheng,X.,Wang,Y.,Dong,X.,Li,J.,&Xu,W.(2017).FBP17promotescellmigrationandproliferationinbreastcancerthroughSRC/FAKandMEK/ERKsignalingpathways.AmericanJournalofCancerResearch,7(2),246.
2.Lee,J.J.,Kim,J.I.,Suda,S.,Gupta,K.,Lee,S.H.,Han,J.,&Motamedi,M.(2020).NovelsignalingaxisforsynapticboutonformationinvolvingAuroraBkinase,Drebrin,andFBP17.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,117(37),23118-23128.
3.Ma,Y.,Gu,H.,Yang,C.,Li,J.,Zhang,Y.,&Ren,J.(2016).SortilinandFBP17mediatetheantiangiogenicactionsofendostatinonendothelialcellsviathephosphatidylinositol3-kinasepathway.MolecularMedicineReports,13(2),1847-1855.
附：实验所需材料和器材
1.TaqDNAPolymerase
2.pEGFP-C1真核重组质粒
3.Lipofectamine3