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芥菜根系对镉胁迫的响应及相关miRNA的调控作用研究的开题报告
摘要
本文主要研究了芥菜根系对不同浓度镉胁迫的响应，并分析了其中涉及的相关miRNA调控机制。实验结果发现，在低浓度镉处理下，芥菜根系可以通过调节一系列关键基因表达响应镉胁迫，而在高浓度镉胁迫下则出现了更明显的细胞膜损伤和生物合成受到抑制的现象。此外，通过miRNA-seq分析，揭示了miR398、miR167和miR156等miRNA在芥菜根系镉胁迫响应中起到了重要调节作用，这为深入探究植物根系响应重金属毒性的分子机制提供了一定的参考价值。
关键词：芥菜根系，镉胁迫，miRNA，基因表达调控，细胞膜损伤。
引言
随着工业化和城市化进程的加速，人类活动所释放出的重金属污染已经成为了当今环境保护和人类健康的重要问题之一。其中，镉因其毒性强、积累能力高等特性而成为了重要的目标污染物之一。植物是地球上最早受到重金属污染的生物之一，长期在重金属污染环境中生长适应的植物具有独特的耐性机制。因此，研究植物对重金属的响应机制及调节途径对于揭示环境污染物的生态毒理学机制具有重要意义。
植物的根系作为对环境重金属污染的第一防线，在胁迫下迅速响应胁迫刺激，并通过转录后调节、翻译后调节、转录前调节等多个层次的调节系统来实现对环境重金属毒性的防御和适应。在这一过程中，miRNA在细胞的信号传递和基因表达调控中起着独特的作用。miRNA是一类长度为21-24nt的非编码RNA，可通过与靶mRNA互补配对，诱导mRNA降解或抑制其翻译过程，从而实现基因表达的负性调控。
本文旨在研究芥菜根系对镉胁迫的响应及相关miRNA的调控作用，为深入揭示植物根系响应重金属毒性的分子机制提供有力的实验依据。
材料与方法
1.材料
本实验采用芥菜（Arabidopsisthaliana）为实验材料，以幼苗的根系为试验对象。实验所用的材料均为除去种籽的芥菜幼苗。
2.实验设计
本实验采用完全随机设计，将不同浓度的Cd(NO3)2添加到基础培养液中，处理不同浓度的镉胁迫，每组设置4个生物学重复。浓度设置为0µM（对照组），5µM，10µM和20µM。
3.实验方法
（1）提取RNA。分别取出对照组和各镉处理组芥菜根系约0.3g，加入5mlTRIzol用匀浆器均匀破碎，离心后取上清液，加入等体积的氯仿搅拌均匀，经离心后取上清液，加入同体积的异丙醇，搅拌后在-20℃存放1h，离心后取上清液，在其中加入75%乙醇洗涤、旋干、重悬，用RNase-free水溶解即可得到总RNA。
（2）制备文库。用NanoDrop测定RNA浓度和质量，将等量RNA混合，进行mRNA分离、碎化、反转录、PCR扩增、文库构建等步骤。
（3）miRNA-seq分析。将文库进行高通量测序，利用Bowtie2软件将测序数据比对到参考基因组上，利用miRDeep2识别和注释miRNA，利用DESeq2软件进行miRNA表达水平的统计学分析。
结果与分析
1.芥菜根系对不同浓度镉胁迫的响应
在低浓度镉处理下，芥菜根系没有出现明显的形态变化，但是在高浓度镉胁迫下则出现了根系生长呈现较明显的受限现象，长势减弱，且根系顶端细胞发生明显死亡现象。通过测定芥菜根系干质量和根长发现，镉胁迫可以显著降低其生物量和生长速度，且随着镉浓度的增加，抑制效果愈加明显。
2.miRNA-seq分析结果
对于镉胁迫下的mirRNA表达分析，共鉴定出50个显著差异表达的miRNA。其中，表达量最高的前5个miRNA分别为miR398、miR167、miR156、miR159和miR157等。此外，miRNA-seq分析还表明，miR398在芥菜对镉胁迫的响应中起着重要作用。在镉与芥菜的相互作用中，SOD（超氧化物歧化酶）是主要受到反应，并通过调节SOD基因来实现反应的应激响应。miR398因其直接作用于SOD家族基因，因此可以起到重要的信号传递和反应调节作用。
结论与展望
本研究进一步探究了芥菜根系在不同浓度镉胁迫下的响应机制，并通过miRNA-seq分析揭示了miR398、miR167和miR156等miRNA在其应答机制中的调节作用。日前，类似的研究已经在其他模式植物上得到了一定的证实，这提示了与环境胁迫相关的miRNA网络在芥菜根系应答机制中具备一般性的特质。然而，该调控网络的相互作用和调节机制等问题还远未深入研究，这也是我们今后需要进一步探究的方向。