水牛抑制素α基因RNAi载体构建与沉默效率检测的任务书.docx

水牛抑制素α基因RNAi载体构建与沉默效率检测的任务书
一、任务概述
RNA干扰技术是一种通过设计和合成靶向特定基因的小分子RNA从而沉默目标基因的方法。在许多生物学领域，RNAi技术已经成为可靠的基因沉默方法。本次任务旨在构建hhOWM9SiRNA载体，并通过体外及体内实验检测其对水牛抑制素α基因的沉默效率。
二、任务背景
水牛抑制素α（Buffaloin）是一种天然的杀虫激素，与昆虫EEG抑制素（InsectEcdysisTriggeringHormone，ETH）同源。研究发现，通过沉默水牛抑制素α基因可以有效控制吸血虫的寄生和繁殖，因此该技术在水牛产业及医学领域具有重要应用价值。
三、任务内容
1.设计siRNA序列
根据水牛抑制素α基因的序列信息，设计两个siRNA序列。从已有文献中筛选出靶向水牛抑制素α基因的siRNA序列，经过BLAST比对和评估，最终获得两个siRNA序列，以便进行后续实验。
2.构建hhOWM9SiRNA载体
在已有的基础上，选择hhOWM9载体作为模板，将双链siRNA序列插入到载体中。首先将siRNA序列合成，并通过PCR扩增得到带有限制酶切位点的DNA片段，然后将该片段与载体线性化后进行连接，最终得到hhOWM9SiRNA载体。
3.制备体外转染复合物
采用聚乙烯亚胺(PEI)作为载体，与hhOWM9SiRNA载体形成复合物为细胞提供siRNA递送。将hhOWM9SiRNA载体与PEI混合，通过离心法制备体外转染复合物并进行质粒的纯化。
4.体外转染效率检测
将制备好的复合物用于转染HEK293T细胞，通过荧光显微镜观察细胞内荧光素的表达和RNA水平的检测，评估hhOWM9SiRNA载体在体外下的转染效率。
5.体内实验
6.1动物实验
将hhOWM9SiRNA载体通过尾静脉注射进入雄性小鼠，并测定其鼠体内BuffaloinmRNA水平的变化情况以检测hhOWM9SiRNA的体内效果。
6.2细胞培养实验
将hhOWM9SiRNA载体转染入C6glioma细胞，测定细胞内BuffaloinmRNA水平的变化情况，进一步测试hhOWM9SiRNA的体内效果。
四、任务进展计划
1.设计siRNA序列，完成BLAST比对和评估。（1天）
2.构建hhOWM9SiRNA载体，纯化质粒。（3天）
3.制备体外转染复合物，进行RNA测序和荧光分析。（1周）
4.完成动物实验，测定鼠体内BuffaloinmRNA水平的变化情况，检测hhOWM9SiRNA的体内效果。（2周）
5.完成C6glioma细胞实验，测定细胞内BuffaloinmRNA水平的变化情况，检测hhOWM9SiRNA的体内效果。（2周）
6.对结果进行汇总分析，撰写实验报告。（2周）
五、任务要求
1.具备分子生物学实验技能和动物实验经验；
2.熟悉RNAi技术原理和流程，具有人工合成siRNA经验；
3.熟练掌握DNA克隆技术，具有PCR扩增和质粒纯化的经验；
4.对体外和体内实验经验较为充分，能够严格控制实验前后的环境，进行数据分析、处理等统计工作；
5.沟通能力和团队合作精神较强，能够与他人进行有效交流和协作。