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PI3KAkt信号通路在体外培养血管瘤内皮细胞中的表达及调控的中期报告
本研究旨在探究PI3KAkt信号通路在体外培养的血管瘤内皮细胞中的表达及其调控情况。本次报告为中期报告，包括了实验设计、实验方法、初步结果及后续工作计划。
实验设计：
本研究选取体外培养的人血管瘤内皮细胞（humanhemangioendotheliomacells，HemEC）为实验对象，用Westernblot和实时荧光定量PCR技术检测PI3KAkt信号通路相关蛋白和基因的表达情况。同时，通过添加PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂MK2206分别抑制PI3KAkt信号通路，观察其对HemEC增殖和迁移的影响，并进一步探究该信号通路对血管瘤发生发展的影响。
实验方法：
1.细胞培养
用DMEM培养基加10%胎牛血清的条件下培养HemEC，维持在37℃、含5%CO2的环境中。
2.Westernblot分析
用RIPALysis缓冲液裂解HemEC获得总蛋白，用SDS-PAGE电泳将蛋白分离后转印到聚乙烯二醇薄膜上，用牛血清白蛋白堵塞10分钟，接着将membrane与PI3KAkt信号通路蛋白(p-Akt,Akt,p-GSK3β,GSK3β)，并用含有HRP的二抗标记蛋白，最终用葡萄糖氧化酶底物生成化合物后进行成像。
3.实时荧光定量PCR
用TRIzol试剂将HemEC裂解并提取总RNA，逆转录生成cDNA，最后用SYBRGreenI探针检测目标基因（PI3K,Akt,GAPDH)的荧光强度，计算相对表达量。
4.细胞增殖和迁移实验
HemEC进行细胞增殖和迁移实验，分别加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002和MK2206，探究其对细胞生长和迁移的影响。
初步结果：
1.Westernblot分析结果表明，HemEC中PI3KAkt信号通路相关蛋白（p-Akt,Akt,p-GSK3β,GSK3β）表达呈正常增长趋势。
2.与对照组相比，使用LY294002和MK2206抑制PI3KAkt信号通路后，HemEC的增殖和迁移能力明显下降。
3.实时荧光定量PCR结果表明，PI3K和Akt基因表达呈正常上调趋势。
后续工作计划：
1.进一步排除实验误差并增加样本量，确定PI3KAkt信号通路在血管瘤内皮细胞中的表达情况及其与血管瘤发生发展的关系。
2.探究PI3KAkt信号通路如何调控血管瘤内皮细胞增殖和迁移，及其对血管瘤生长和蔓延的影响。
3.通过PI3KAkt信号通路来寻找血管瘤的治疗靶点，为临床治疗提供参考。