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飞蝗羧酸酯酶基因的克隆和原核表达的中期报告
综述
本研究旨在克隆飞蝗羧酸酯酶基因并实现原核表达。通过PCR扩增飞蝗羧酸酯酶基因后，将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。接下来将进行进一步鉴定和纯化，并进行活性检测。
方法
1.PCR扩增
使用专用引物在飞蝗样品中扩增羧酸酯酶基因片段。反应体系为：2×TaqMasterMix12.5μl、DNA模板1μl、引物（10μM）1μl（引物序列为：Forward:5’-ATGGCTCGGTGACATACGACCG-3’，Reverse:5’-TCGATTCTCATTGCGCTTCGTCG-3’），水调节至25μl。PCR反应条件为：95℃5min，35个循环（95℃30s，55℃30s，72℃1min），72℃7min，保持4℃。
2.克隆
将PCR产物与pET-28a(+)载体进行双酶切后，LigationMD51®连接酶连接并转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。转化后的细胞在含有50μg/ml的kanamycinLB平板上进行筛选。
3.鉴定
通过PCR检测克隆是否成功，再通过测序验证基因序列是否正确。同时，纯化大肠杆菌BL21(DE3)细胞中的表达产物，利用SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。
4.原核表达
将BL21(DE3)中表达产物在IPTG诱导的条件下进行表达至最适载体处。通过Ni-NTA亲和柱纯化表达产物，并用BCA法检测蛋白质浓度。
5.活性检测
通过酶活性测定（酯化反应）检测目标酶的活性。
结果
1.PCR扩增
通过PCR扩增，得到约1692bp的目标基因片段。
2.克隆
将目标基因片段克隆至pET-28a(+)载体中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，筛选出正常含有目标基因的菌落。
3.鉴定
目标基因DNA序列正确，表达产物通过SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定，证实表达产物已经成功表达。
4.原核表达
通过IPTG诱导，在BL21(DE3)表达产物中以可溶性的形式表达出目标蛋白质，表达量约为70μg/ml。
5.活性检测
通过酯化反应检测到目标酶活性，并确定反应条件（pH值、温度等）。
结论
本研究成功克隆与原核表达飞蝗羧酸酯酶基因，同时验证表达产物已正常表达并确保蛋白质质量，通过酶活性检测得到了目标酶活性，并针对其反应条件进行了优化。