应用PCR及DoT-ELISA技术建立肝片吸虫检测方法的研究的中期报告.docx

应用PCR及DoT-ELISA技术建立肝片吸虫检测方法的研究的中期报告
本研究旨在建立一种可靠的肝片吸虫检测方法，采用PCR和DoT-ELISA技术结合的方法，中期已完成以下工作：
一、提取肝片吸虫基因组DNA
从肝片吸虫样本中提取基因组DNA。首先进行体段分离、碎片化、蛋白酶K消化、酚-氯仿法和异丙醇洗涤等步骤，最终获得高质量的基因组DNA，可用于PCR技术检测。
二、PCR扩增轻链组织胺基酸脱氨酶基因
利用肝片吸虫基因组DNA为模板，使用特异性引物扩增轻链组织胺基酸脱氨酶基因。PCR反应系统为25μl，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共循环36次。通过凝胶电泳检测，出现目标长度的DNA条带，说明PCR扩增成功。
三、构建DoT-ELISA检测方法
1.克隆PCR产物
将PCR扩增得到的轻链组织胺基酸脱氨酶基因片段克隆入pUC19载体，构建重组质粒。
2.提取重组抗原
将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，表达蛋白并将其纯化。将纯化后的重组抗原分别涂覆于肝片吸虫阳性和阴性对照纸条上。
3.DoT-ELISA检测
在DoT-ELISA板上吸附不同浓度的抗体，分别添加阳性和阴性样本及对照纸条。通过洗涤、添加辣根过氧化物酶标记的二抗、显色等步骤后，在紫外分光光度计上进行读数和计算。
目前已初步建立了DoT-ELISA检测方法，初步结果表明该方法可靠，但仍需进一步优化和实验验证。
总之，本研究在提取肝片吸虫基因组DNA、PCR扩增轻链组织胺基酸脱氨酶基因和构建DoT-ELISA检测方法方面已取得了初步进展，为最终建立可靠的肝片吸虫检测方法奠定了基础。