产κ-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化.pdf

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产K一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化李俊，马悦欣，冯兵，于杨1材料与方法卡拉胶是某些红藻种类的细胞壁多糖。依据其大连水产学院学报摘要：对K一卡拉胶酶产生菌进行富集培养，以K一卡拉胶为唯一碳源的平板初筛，从多种海藻上分离纯关键词：卡拉胶酶产生菌；筛选；发酵条件；优化中图分类号：Q939．9文献标志码：A结构，可将卡拉胶分为K一、入一、。一卡拉胶等。K一卡拉胶是由1，3一连接的B—D一半乳糖4一O一硫酸基和l，4连接的3，6内醚一q—D一半乳吡喃糖交替连接的半乳匀多糖⋯。目前已从假单胞菌属Pseudomonas¨q1、噬纤维菌属Cytopha—ga[4-61、弧菌属V／br／o【71中发现K一卡拉胶酶。K一卡拉胶酶是一种有用的工具酶，能水解K一卡拉胶的B—l，4糖苷键产生一系列同源偶数寡糖，可用于红藻细胞壁结构的分析和原生质体的分离。已有研究表明，卡拉胶和卡拉胶的降解产物具有抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性【8-11]。有关K一卡拉胶酶产生菌株的培养条件优化国内外报道较少”】。作者从亮管藻体上筛选出一株卡拉胶酶活力较高的HC4菌株，并对其产酶培养基和培养条件进行了优化，使其产酶能力有很大提高。1．1培养基的组成各种培养基的组成见表l。无机盐母液的配方为：K2HP04·3H20g／L。1．2菌株的筛选将多种海藻样品进行富集培养，以K一卡拉胶为唯一碳源的选择性培养基初筛分离K一卡拉胶降解菌，根据菌落周围透明圈或凹坑的大小初步判断菌种的卡拉胶降解能力，筛选出具有K一卡拉胶酶活性的菌株。进一步通过摇瓶培养进行复筛，将菌株于斜面培养基上活化24h后，接人种子培养基，振荡培养24h后，以4％接种量接入装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中，于32℃下以150r／min振荡培养48h，检测发酵液的产酶活力。JOURNAL化获得32株具有卡拉胶酶活性的菌株，经摇瓶复筛，从亮管藻上分离的HC4菌株酶活力最高，为50．75U／mL。测定了HC4菌株的16SrRNA基因序列1436bp，在核苷酸序列数据库(NCBI)中进行同源性检索，发现它与Tamlanaagarivorans的相似性为98％。通过单因子筛选和正交试验，确定该菌株产酶的最佳培养基组成为：碳源K一卡拉胶5g／L；氮源蛋白胨3g／L；无机盐NaCIg／L、l(2HP04·g／L和CaCl2g／L。最佳培养条件为：摇床转速150mL三角瓶中发酵培养基的装液量50mL，接种量4％，发酵培养基起始pH7．5，温度28℃，培养时间28h。经培养基组成及培养条件优化后，HC4菌株的K一卡拉胶酶酶活力提高到602．30U／mL，是优化前的11．87倍。g／L，CaCl2l表1培养基的组成第24卷第l期9年2月OFDALIANFISHERIESUNIVERSITY文章编号：1000—9957(2009)01-0024—06(大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，辽宁大连116023)g／L和NaN03g,／L、MgS04·7H2010g／L，MgS04·7H205g／L，FeP04-4H200．1Componentsmedia注：培养基用陈海水配制，pH为7．5，每种培养基还需添加无机盐母液100mL。收稿日期：2008—03—07基金项目：大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室开放项目(I(2006—12)作者简介：李俊(1981一)，女，硕士研究生。通信作者：马悦欣(1963一)，女，教授。E—mail：mayuexin@dlhrV01．24No．1Feb．20091203H200．5r／rain，250Tab．1oftheculture20edu．cn
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2结果与讨论每分钟产生1蝎还原糖(以半乳糖计)所需要的卡拉胶酶的活力。前一步优化的条件用于后一步试1．5．5正交试验设计正交试验设计参照《工业培养温度基础上，改变摇瓶转速、接种量、装液量株，摇瓶复筛结果表明，从海带、江篱、蜈蚣藻和较高，分别为35．54、30．28、46．45一碳源进行试验，其中菌株在以K一卡拉胶为唯一第1期李俊，等：产K一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化1．3酶活力的测定发酵液经离心去除菌体后，取上清液与底物反应，根据还原糖的产生判断K一卡拉胶酶的活力。1个酶活力单位(U)定义为：在32℃下，酶量。HCA菌株的16SrRNA基因序列测定和分析利用引物对F27和R1492【12】对HCA菌株的rRNA基因进行PCR扩增，使用ABI测序仪对PCR扩增产物进行序列测定并双向测通(北京华大基因研究中心)。将所测序列在C,enBank数据库(NCBI)用BLAST分析(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／SLAST)D3]。Hc4菌株产酶条件的优化在发酵培养基基