预览加载中,请您耐心等待几秒...
1/9
2/9
3/9
4/9
5/9
6/9
7/9
8/9
9/9

在线预览结束,喜欢就下载吧,查找使用更方便

如果您无法下载资料,请参考说明:

1、部分资料下载需要金币,请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档,再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压,在使用对应软件打开

DB37/TXXXXX—XXXX PAGE\*MERGEFORMAT2 ICS FORMTEXT65.150 FORMTEXTB50 FORMTEXT     DBFORMTEXT37 FORMTEXT山东省地方标准 DBFORMTEXT37/T4058—2020 FORMTEXT      FORMTEXT水生动物细菌性病原检测技术规范 FORMTEXTInspectionprotocolforbacterialpathogensofaquaticanimals 2020-07-09发布 2020-08-09实施 FORMTEXT山东省市场监督管理局   发布 DB37/T4058—2020 PAGE\*MERGEFORMAT5 前  言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省渔业标准化委员会(鲁TC03)归口。 本标准起草单位:威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。 本标准主要起草人:侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、刘振华。 水生动物细菌性病原检测技术规范 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原(Bacterialpathogensofaquaticanimals)检测的试剂与材料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。 本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范 SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分:通用技术 SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 试剂与材料 试剂与材料应符合GB4789.28和附录A的规定。 仪器设备 按照SC/T7201.1的规定执行。 采样 采样用具 应使用无菌采样用具。 采样数量、个体要求、采集部位 按照SC/T7014—2006中第6章的规定执行。 样品运输及保存 按照SN/T2123的规定执行。 细菌性病原分离培养 分离培养 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后,采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式,在28 ℃~30 ℃培养24 h;低温下取样应在15 ℃~18 ℃同步培养24 h。 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器,并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠(分别研细均匀,临用前混合置于一平皿内)各30 g/1 000 mL容积,然后将干燥器盖严,用凡士林密封,在28 ℃~30 ℃培养24 h;低温下取样则应在15 ℃~18 ℃同步培养24 h。 严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。 纯培养 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落,接种于相应培养基上,按照6.1.1的方法培养。 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落,接种于相应培养基上,按照6.1.2的方法培养。 多次纯培养 若经过纯培养后,未能得到形态特征基本一致的单菌落,可进行多次纯培养,直到获得形态特征基本一致的单菌落,操作步骤应符合6.2的要求。 病原菌检测 病原菌16SrDNA序列分析 菌落PCR 按照附录B执行。 结果判定 PCR结果可靠 DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带,阳性对照可见1472 bp左右DNA条带,且阴性和空白对照样品无条带出现,则PCR实验结果可靠,可进行样品分析。 电泳失败 DNAMarker标准样品未出现条带,则电泳失败,应检查电泳试剂重新进行电泳。 检测结果无效 DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带,阳性对照无条带或者DNA条带非1472 bp左右,或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带,则试验结果无效,应重新进行PCR扩增。 克隆、测序和比对 将7.1.2样品扩增条带克隆、测序,序列输入到NCBI网站进行比对,确定细菌的属种。 病原菌生化特性检测 按照SC/T7014—2006中的9.4规定执行。 结果综合判定 需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定,需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。 (规范性附录)试剂的配制 TE缓冲液 A液:1 mol/LTris·HCl(pH8.0) 称取Tris碱6.06 g,加去离子水40 mL溶解,滴加浓H