进出口河豚中河豚毒素检验方法_ELISA法_编制说明.doc

《进出口河豚中河豚毒素检验方法ELISA法》
编制说明
一、任务来源
根据国家质检总局2009年《关于下达2009年检验检疫科研（技术开发）标准制（修）订项目计划的通知》下达的编写任务通知(计划编号2009B750r)，由辽宁出入境检验检疫局主持中华人民共和国国家出入境检验检疫行业标准《进出口河豚中河豚毒素检验方法ELISA法》SN/T1569-2005的修订工作。
二、编制本标准的目的和意义
河豚毒素（TTX）是一种强神经毒素（对人的致死剂量为0.5～1.0mg），其性质稳定，加热、盐腌及高温烹煮均不易使其被破坏。河豚鱼中常含有河豚毒素。河豚味道鲜美，营养丰富，我国沿海居民素有食用河豚鱼的习惯。因误食或食用加工不当的河豚鱼而发生人畜中毒的事件每年都有发生。故准确检测河豚鱼中的河豚毒素对预防和控制河豚毒素中毒，具有重要意义。
鉴于河豚中毒给人类健康带来的严重危害，我国《水产品卫生管理办法》规定严禁河豚鲜售。但由于人们对河豚的喜爱和河豚在国际市场上昂贵的价格，我国沿海地区鲜河豚的非法制售活动禁而难止，其带来的危害日益严重。随着改革开放的深入，各企业和主管部门、各级卫生监督部门要求合理利用我国丰富的河豚资源，扩大出口创汇和满足人们消费需要的呼声越来越高。目前有关部门已同意进行河豚鲜食的可行性研究。这一工作迫切需要一种可靠、快速、灵敏、简便的TTX检测技术。根据文献报道，TTX的检测方法有小鼠生物试验法、薄层色谱法、高效液相色谱法等多种方法。这些方法大多灵敏度较低，仪器分析价格昂贵，所需的样品前处理也非常复杂。小鼠生物测定需要专门的动物，难以适应实际工作的需要。以单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）为基础的免疫化学检测方法，具有快速、简便、灵敏、经济的特点，将McAb应用于TTX检测，20世纪90年代国外有个别成功的报道。我们所建立的单克隆抗体直接竞争抑制性ELISA法，使TTX的检测更为快捷、灵敏，从而更能满足河豚毒素快速筛选的需要。
目前有关单克隆抗体用于检测河豚毒素的报道很少。Watabe等用酶联免疫吸附试验得到的检出限为0.03～100μg/孔（0.3～1000μg/mL），但作者未介绍检测方法。Raybould等报道了竞争抑制酶免疫试验检测方法，用碱性磷酸酶标记单克隆抗体，间接法的最高灵敏度为30ng/mL，直接法为2～3ng/mL。由于单克隆抗体检测方法快速、简便、灵敏、特异、经济，因此这种方法的推广应用有着广泛的前景。因此迫切需要修订、完善原有管理办法，做到既发挥河豚资源在促进经济发展中的作用，又保障消费者的身体健康。这一工作需要一种可靠、先进、可行的方法为基础，因此筛选、建立一种能满足上述要求的河豚毒素检测方法是十分必要的。
三、本标准的修订内容
本标准是按照GB/T1.1《标准化工作导则第1单元：标准起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》及SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求而进行编写的。其中测定方法是参考有关文献中所载的河豚毒素分析方法，经研究、改进和验证后，按规定格式编写的。在标准中同时制定了抽样方法和制样方法。
本标准代替SN/T1569-2005《进出口河豚中河豚毒素检验方法—ELISA法》
本标准与SN/T1569-2005《进出口河豚中河豚毒素检验方法—ELISA法》的主要差异如下：
1、修改了标准范围
本标准对TTX的检出限为1ng/g。
2、修改了仪器和设备
微量加样器及配套吸头100μL、200μL、1000μL。
玻璃器材量筒、烧杯、容量瓶。
3、修改了酶标板包被程序
将BSA-HCHO-TTX用0.05mol/LPBS稀释至20μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用PBS-T洗板3次，每次3min，加3mg/100mL的200μL牛白蛋白于20℃±1℃封闭30min，用PBS-T洗板3次，每次3min，待用。
4、修改了底物溶液和检测波长
TMB底物液代替OPD底物液；检测波长450nm代替490nm.
5、修改了附录A
增加了TMB底物溶液的配制方法。
TMB底物溶液
TMB储存液：200mgTMB溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺中而成，4℃避光保存。
底物溶液：将75µLTMB储存液、10mL底物缓冲液和10µLH2O2混合而成。
四、本标准研究的内容
1、方法的选择
对于河豚毒素的检验，直接竞争酶联免疫法不但灵敏度高，特异性强，而且检测速度快，操作简单，测量样品种类多，还可同时检测大量样品。
2、样品的保存
鲜活河豚取样后，应立即送交实验室，实验室不能马上检测，应立即速冻，检测时以常温流水快速解冻，尽快解剖，分成皮肤、肌肉、肝脏、精巢等分别盛放。因其各部位毒性不同，如其长期