小鼠SP-B shRNA真核表达载体的构建、鉴定及有效序的筛选的综述报告.docx

小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建、鉴定及有效序的筛选的综述报告
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建、鉴定及有效序的筛选
小鼠SP-B（MouseSurfactantProteinB）是一种肺泡表面活性物质，是一种重要的磷脂体成分。它在肺泡防止表面张力的作用中起重要作用。对小鼠SP-B的研究可以有助于理解这种蛋白质在肺部疾病中的作用及其机制。本文将综述小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建、鉴定及有效序的筛选。
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建需要选用合适的质粒载体作为基础，如pSilencer2.1-U6neo或pSUPER.retro.puro等。其中pSilencer2.1-U6neo质粒含有多个限制酶切位点，同时也含有调节片段，可以在转录水平上调节shRNA的表达量。此外，该质粒具有抗生素耐受性基因，可以方便筛选转染细胞。
在选择质粒载体之后，需要设计shRNA序列。shRNA是一种小分子RNA，介于siRNA和miRNA之间。它的特点是长度较长（一般为21-23个核苷酸），含有环状结构。shRNA可以在细胞内经Dicer剪切成为小分子siRNA，从而抑制目标基因的表达。小鼠SP-B的shRNA序列可以采用在线软件设计，如siRNAWizard（Invitrogen）或siRNATargetSequenceSelector（GeneLink）等。设计shRNA时需要注意避免与非靶向基因产生序列相似性，以防止非特异性抑制。
接下来，需要将shRNA序列插入到质粒载体中。可以采用限制性内切酶酶切法或Klenow填充法。在限制性酶切法中，需要先将质粒载体线性化，然后利用同源重组的原理将shRNA序列插入载体中。填充法则是：将shRNA序列合成带A尾的寡核苷酸，再与线性化的载体连接。当然，这种方法需要先用QEPCR或PCR检测shRNA序列是否成功插入到质粒中。
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的鉴定
最终构建好小鼠SP-BshRNA真核表达载体后，需要进行鉴定。首先需要利用限制性内切酶切碎质粒，然后用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，最后通过梯度电泳纯化获得纯DNA。鉴定质粒的纯度，可以进行UV扫描波长检测质量。
其次，就是从该复合载体中纯化获得成品载体，实现该过程需要含有shRNA的载体亚克隆到兼容细胞的亚克隆，比如EcoRorDH5等。在实施过程中，将基因植入感受性细胞的能力需要有鉴定，试图获取阳性转染克隆。
小鼠SP-BshRNA有效序的筛选
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的有效序的筛选是非常有必要的，因为设计好的shRNA序列可能存在噪声，难以在细胞内找到治疗或疾病研究的应用。有效序的筛选实质基于筛选植入的shRNA序列能够成功地沉默研究对象的基因。
可以将小鼠SP-BshRNA真核表达载体转染至研究对象的细胞中，利用real-timePCR或Westernblot等技术来评估小鼠SP-B的表达水平。同时还可以对成熟的shRNA获得互补的siRNA分子用于检测是否抑制了SP-B的表达。需要注意的是，在评估shRNA效用时，应该包括使用非特异性shRNA或空载体的对照实验。
总结
小鼠SP-BshRNA真核表达载体的构建、鉴定及有效序的筛选，是对该基因表达调控产生重要影响的过程。尽管这个过程非常复杂，但可以利用现代分子生物学技术和实验流程逐步完成，并为小鼠SP-B的深入研究提供有效工具。