双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介.docx

双萤光素酶报告基因的应用常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-LuciferaseReporterAssay）通常以萤火虫萤光素酶(Fireflyluciferase)为报告基因以海肾萤光素酶(Renillaluciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。Fireflyluciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下催化luciferin氧化成oxyluciferin在此过程中发出最强波长在560nm左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低可以反映是否存在靶向互作。Renillaluciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide此过程中发出最强波长在465nm左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动在报告系统中作为校正input误差的内参信号。生物萤光产生反应式一、应用方向1.验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体再共转入该microRNA如果萤光素酶活性下降则提示为其靶序列。2.验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域检测萤光素活性。3.启动子结构分析。将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短或对特定位点进行突变再分别构建入luciferase报告载体检测其启动子活性。4.启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。5.验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体同时在实验细胞中共转过表达该转录因子可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。6.可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体在不同上游信号条件下萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在GPCR研究中将cAMPresponseelement（CRE）载入报告基因载体构建稳定表达细胞株后可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如将HIF1α的响应原件hypoxia-responsiveelement(HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株可以用于低氧相关通路的研究。二、常用萤光素酶报告基因载体pGL3-BasicpRL-TKpmirGLO三、经典案例案例一题目：Longnon-codingRNAlinc00673regulatednon-smallcelllungcancerproliferationmigrationinvasionandepithelialmesenchymaltransitionbyspongingmiR-150-5p期刊：MolecularCancer小结：验证linc00673具有miR-150-5p的靶向结合位点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirGLO-linc00673-WT同时构建靶位点突变的pmirGLO-linc00673-MUT分别共转miR-150-5pmimics及NCmimics结果显示miR-150-5p转染组的相对荧光值降低提示存在靶向结合。图：RNA与质粒共转染293T24h后双萤光素酶检测案例二题目：SOX9indirectlyregulatesCEACAM1expressionandimmuneresistanceinmelanomacells期刊：Oncotarget小结：验证SOX9对于CEACAM1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel和624mel对CEACAM1的启动子区域分别选择了600bp-200bp的截短片段共转染过表达