不同产地丹参的 TRAP 分子标记研究.doc

[摘要:]采用新型分子标记TRAP对不同产地的丹参进行研究,建立丹参鉴别的新方法,并探索其遗传变异规律。应用CTAB法提取DNA,采用PopGene32软件进行聚类分析,并构建遗传系统树。筛选的6对引物扩增出203个条带,其中多态性条带为43,占21.1%。聚类分析结果显示4种丹参被分为2类群3亚群,其遗传一致性平均为0.0788,遗传距离平均为0.9245。实验结果表明:TRAP分子标记技术可以在分子水平上鉴别丹参的不同品种,四地丹参具有较高的遗传稳定性。
[关键词]:丹参;目标区域扩增多态性;中药鉴别;分子标记
[Abstract]:ThemolecularmakersystemTRAPwasutilizedtodevelopanovelmoreaccuratetooltoidentifyhevarietyandestablishtheevolutionaryrelationshipofdifferentkindofSalviamiltiorrhizaBge.PopGene32softwarewasappliedtoconducttheclusteranalysisandgeneticdendrogramestablishment.Theresultsshowedthat203differentfragmentswereamplifiedwith6pairprimersusingtheTRAPmarkersystem.Thepolymorphicfragmentsnumberis43,whichtakesupto21.1%.Theclusteranalysisshowsthatthe4materialsweusedinthisstudycanbeclassifiedinto2maingroupsand3subgroups.Thegeneticidentityis0.0788andtheaveragegeneticdistanceis0.9245amongthefourmaterialsinthisstudy.AnewtoolusingtheTRAPmarkersystemismoreaccurateandcanbeusedtoidentifydifferentkindofSalviamiltiorrhizaBgeatmolecularlevel.
[Keywords]:SalviamiltiorrhizaBge;TRAP;identificationofTCM;molecularmarker

丹参为唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根茎,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的作用,适用于血淤、血热等所致各种病证。现代药理研究表明,丹参对心血管系统作用十分明显,已成为治疗心脑血管疾病最常用的中药之一。由于野生资源逐渐减少,许多地区进行丹参人工栽培,不同产地及栽培技术引起的质量差异十分显著,因此对丹参进行鉴别和遗传变异研究十分重要
TRAP(targetregionamplifiedpolymorphism,目标区域扩增多态性)是2003年发展起来的新型标记系统[1]。TRAP具有操作简单、稳定性好、效率高的特点,已经成功应用于多种植物的研究13]。
本实验应用TRAP技术对丹参进行了分析研究,为不同产地丹参的鉴定提供新方法,为丹参种质资源和遗传多样性的研究提供一定的科学依据。
材料与方法
材料丹参采自河南方城、四川中江、陕西商州和江苏射阳,由本校药学院张丽娟副教授鉴定为丹参SalviamiltiorrhizaBge。
EST筛选在NCBI(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation)的dbESTdatabase(data-baseforexpressedsequencetags)[4]查到丹参注册的EST共10288条,逐条复制粘贴到kegg(KyotoEn-cyclopediaofGenesandGenomes)的KEGGpathway系统[5]对丹参的EST进行代谢途径分析,从中筛选到与丹参酮和丹参素代谢相关的EST103条,再挑选长度在300～800bp的EST20条用于引物设计。
引物筛选固定引物,针对上述20条EST,利用oligo6.44软件设计,每条EST设计一条引物,共20条。随机引物应用Hu[1]设计的4条原引物。4条随机引物和20条固定引物相互搭配,共形成80对引物。经过筛选实验,从中筛选出6对扩增条带丰富、信号清晰、重复性好的引物用于TRAP分析。
所用随机引物如下:A1:5'GGAACCAAACACATGAAGA3';A2:5'TTCTTCTTCCCTGGACACTT3';
A3:5'CTATCTCTCGGGACCAAAC3'。