水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建的综述报告.docx

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建的综述报告
水母雪莲（Eimeriasinensis）是我国的一种高效能、低毒害的天然抗疟疾草本植物，其背生物（Plasmodiumfalciparum）能够引起恶性疟疾，是一种导致全球数百万人死亡的危险疾病。因此，研究水母雪莲对疟疾的抗体反应机理和药物产生机制有着重要的意义。DFR基因是参与水溶性花色素（anthocyanin）Biosynthesis的关键基因，其编码的酶能够转化已有的花色素前体Dihydrokaempferol（DHK）为Leukoanthocyanin（LC）和花色素芸苔素（GTP），因此DFR酶的创新研究在植物代谢途径中具有极为重要的意义。
在DFR基因的研究中，克隆基因序列并制备表达载体是重要的步骤。利用RT-PCR技术，流程包括提取总RNA、分离mRNA、合成cDNA、扩增DFR基因等。这些主要的流程步骤都采用了标准的操作方法进行，其中最核心的就是扩增DFR基因的反应条件。由于DFR基因长度较长（约1.2kb），因此需要设计合适的引物。引物的设计需要遵循一定的原则，如引物长度要适当，引物与基因序列间有足够的差异性，等等。经过多次优化条件，终于成功扩增出全长DFR基因序列。然后再将DFR基因定向克隆到pGEM-T-Easy载体中进行测序，测序结果表明，DFR基因的长度为1179bp，编码392个氨基酸。
接下来，将DFR基因转换为植物表达载体是接下来进行的关键。常见的植物表达载体有pCAMBIA、pBI和pGEX等，这三个载体中，pCAMBIA载体在植物转化方面表现优异，因此被广泛应用。构建载体可以采用基因重组技术，Stepone-PCR扩增方法，具体操作流程包括：扩增基因片段（pGEM-T-Easy载体中克隆DFR基因）、纯化PCR产物、消化pCAMBIA载体、进行连接反应、转化细胞等步骤。通过序列分析和酶切鉴定，得出了正确的克隆片段，并进行细胞转化，得到成功的植物表达载体。另外，反义载体的构建原理和正义载体基本相似。
DFR基因在植物代谢途径中的作用，在植物产生花色素类物质和其他抗氧化物质中具有重要意义，近年来的研究表明，DFR基因的表达和疟疾等疾病的抵御具有一定关系。因此，进一步探索DFR基因和水母雪莲的关系，可以为疟疾的预防和治疗提供新的思路和理论基础。
综上所述，水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建是必要和复杂的，但具有重要的研究价值。后续的研究可以通过将该载体转化到大规模培养的植物中，进行大规模基因表达和酶活性检测，从而更好地了解DFR的调控机制，在药物开发等领域具有广泛的应用前景。